發(fā)布時(shí)間：2017-12-23 20:29

  本文關(guān)鍵詞：干細(xì)胞來源微囊泡在化療損傷性卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中的作用　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源微囊泡的分離純化目的:建立一個(gè)高效的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)來源微囊泡的(microvesicles,MVs)分離純化方法。方法:在無血清條件下培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,收集P3-7代干細(xì)胞培養(yǎng)液上清,分別采用傳統(tǒng)超速離心法、改良超速離心法及蔗糖梯度離心法分離純化MVs,通過Bradford蛋白定量法比較三種方法MVs獲取量,透射電鏡鑒定MVs的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果:(1)干細(xì)胞的分離提取及培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)第6-7d,少量細(xì)胞從組織塊游出,呈多角形;第17-20d,細(xì)胞達(dá)80%融合,平行排列或旋渦狀生長。第3代干細(xì)胞為均一長梭形,生長迅速,可穩(wěn)定傳代。(2)微囊泡的分離方法比較及形態(tài)特征改良超速離心法所得微囊泡量顯著高于傳統(tǒng)超速離心及蔗糖梯度離心法(p0.05),每106個(gè)干細(xì)胞約可獲得162.66±17.50μg微囊泡。電鏡下MVs呈圓形或橢圓形,直徑介于20-200nm之間,中間為低電子密度區(qū)。結(jié)論:改良超速離心法可獲得高蛋白濃度的微囊泡第二部分微囊泡在小鼠卵巢內(nèi)的定位與分布目的:觀察微囊泡經(jīng)尾靜脈注射后在小鼠卵巢內(nèi)的定位情況。方法:用PKH26標(biāo)記MVs,將MVs經(jīng)尾靜脈注射入化療損傷性卵巢早衰小鼠及正常小鼠體內(nèi),12h、24h、48h、72h、1w取出卵巢,冰凍切片,FSHR及DAPI免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡下觀察MVs在正常小鼠及化療損傷小鼠卵巢內(nèi)的分布與定位。結(jié)果:PKH26標(biāo)記的MVs(PKH26-MVs)尾靜脈注射后12h即可在損傷卵巢卵泡膜層見少量紅色熒光信號(hào),24h后損傷卵巢紅色熒光信號(hào)顯著增多,與正常卵巢相似,48h后損傷卵巢內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到最強(qiáng),卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光,表明微囊泡已被顆粒細(xì)胞攝取。72h后損傷卵巢內(nèi)熒光強(qiáng)度仍未衰減。1w后兩組卵巢內(nèi)僅見少量熒光殘留。結(jié)論:MVs經(jīng)尾靜脈注射后,12h即可進(jìn)入卵巢組織,并可被顆粒細(xì)胞攝取;隨時(shí)間延長大量分布于正常及化療損傷小鼠卵巢內(nèi)。第三部分微囊泡在化療損傷性小鼠卵巢功能重建中的作用及機(jī)制目的:探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源微囊泡對化療藥物損傷性卵巢早衰小鼠卵巢功能的影響及機(jī)制。方法:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組:建模對照組、正常對照組和建模移植組。通過一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)200mg/kg和白消安(BUS)20mg/kg建立卵巢早衰小鼠模型。將MVs經(jīng)尾靜脈注射入建模移植組小鼠體內(nèi),并取等量PBS經(jīng)尾靜脈注射至建模對照組和正常對照組小鼠體內(nèi),每周重復(fù)1次。每日陰道涂片HE染色觀察小鼠動(dòng)情周期變化,并觀察小鼠體重變化。適宜條件下飼養(yǎng)4周后,卵巢組織石蠟切片HE染色觀察并計(jì)數(shù)卵泡及血管,ELISA法檢測血清性激素變化,免疫組化法檢測并計(jì)數(shù)黃體CD34+內(nèi)皮細(xì)胞,q PCR法檢測卵巢組織血管生成相關(guān)基因VEGF、IGF-1、Angiogenin的表達(dá)水平,Western Blot法檢測卵巢組織血管生成相關(guān)蛋白VEGF以及血管相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)蛋白Akt及p-Akt的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)化療藥物損傷性卵巢早衰小鼠模型建立建模組小鼠在注射CTX及BUS期間動(dòng)情周期紊亂、卵巢間質(zhì)纖維化嚴(yán)重,各級(jí)卵泡與正常對照組相比明顯減少(p0.05),損傷卵泡比例顯著增加(p0.05)。血清E2水平顯著降低(p0.05),FSH水平顯著升高(p0.05)。(2)小鼠一般情況建模對照組小鼠行動(dòng)緩慢,喜弓背蜷縮,體毛晦暗無光澤,體重隨著時(shí)間明顯下降(p0.05),動(dòng)情周期紊亂。建模移植組小鼠在MVs注射后2周動(dòng)情周期逐漸恢復(fù),至移植后4周75%的小鼠恢復(fù)正常動(dòng)情周期,體重顯著增加(p0.05)。(3)卵巢組織學(xué)觀察建模對照組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)紊亂,血管明顯減少,間質(zhì)纖維化嚴(yán)重,卵母細(xì)胞碎裂、溶解,顆粒細(xì)胞排列紊亂,各級(jí)卵泡數(shù)均顯著低于正常對照組(P0.05)。建模移植組小鼠卵巢組織切片可見各級(jí)卵泡,卵母細(xì)胞形態(tài)均一,顆粒細(xì)胞放射狀層疊排列,間質(zhì)血管豐富,間質(zhì)纖維化明顯改善,各級(jí)卵泡數(shù)均顯著高于建模對照組(p0.05)。(4)血清FSH和E2水平測定與建模對照組相比,建模移植組小鼠血清E2水平顯著增加(p0.05),FSH水平顯著降低(p0.05)。(5)血管及CD34陽性內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)建模移植組小鼠卵巢血管數(shù)及黃體CD34陽性細(xì)胞數(shù)均顯著高于建模對照組(p0.05),但仍顯著低于正常對照組(p0.05)。(6)血管相關(guān)基因的m RNA表達(dá)水平q PCR法顯示建模移植組小鼠卵巢血管相關(guān)基因VEGF、IGF-1、angiogenin的m RNA表達(dá)水平均顯著高于建模對照組(p0.05)。(7)促血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)水平Western Blot法顯示建模移植組小鼠促血管生成相關(guān)蛋白VEGF、Akt及p-Akt的表達(dá)水平均顯著高于建模對照組(p0.05)。結(jié)論:(1)單次腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)200mg/kg及白消安(BUS)20mg/kg可建立穩(wěn)定的小鼠卵巢早衰模型。(2)微囊泡能部分改善化療藥物對卵泡的損傷,改善卵巢的內(nèi)分泌功能。(3)微囊泡通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路,使促血管生成相關(guān)因子生成增加,促凋亡物質(zhì)減少,促進(jìn)血管增生,改善卵巢微循環(huán),從而對化療損傷的卵巢起到修復(fù)及保護(hù)作用
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R711.75

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