本文關(guān)鍵詞：九種發(fā)熱伴出疹病原體基因芯片檢測方法的建立　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:發(fā)熱伴出疹性疾病(RFIS)是以發(fā)熱和出疹為主要臨床癥狀,伴有全身或局部皮膚及粘膜出疹,并可能引發(fā)其他臨床癥狀的一系列疾病的總稱,包括麻疹、風(fēng)疹、傷寒、猩紅熱、流行性出血熱、斑疹傷寒、流行性腦脊髓膜炎、水痘、帶狀皰疹、天花等,已經(jīng)列入我國重點(diǎn)監(jiān)測的傳染性疾病的范疇之內(nèi)。導(dǎo)致該類疾病的病原體包括病毒和細(xì)菌兩大類,主要有麻疹病毒、腸道病毒、風(fēng)疹病毒、登革熱病毒、人類小DNA病毒B19、水痘-帶狀皰疹病毒以及溶血性鏈球菌、傷寒沙門氏菌。這些病原體多數(shù)在潛伏期或臨床癥狀不明時(shí)已具有傳染性。目前發(fā)熱伴出疹性疾病的檢測方法主要有分離培養(yǎng)、PCR法和免疫學(xué)診斷法,這些方法均不能滿足同時(shí)檢測多種病原體的需要。本文研究目的是建立一種能準(zhǔn)確、同時(shí)、快速的檢測九種發(fā)熱伴出疹病原體的化學(xué)發(fā)光基因芯片的方法,即腸道病毒71型、登革熱病毒、風(fēng)疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、麻疹病毒、人類小DNA病毒B19、柯薩奇病毒A16型、A組β型溶血性鏈球菌、傷寒沙門氏菌。方法:通過文獻(xiàn)調(diào)研確定待檢測的病原體及其病原體的靶基因,從每個(gè)病原體靶基因的高度保守區(qū)序列中設(shè)計(jì)引物與探針,并篩選出特異性的引物和探針。進(jìn)行多重不對稱PCR擴(kuò)增,將帶有標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與帶有特異性探針的芯片雜交,經(jīng)洗滌,化學(xué)發(fā)光顯色后進(jìn)行結(jié)果分析。優(yōu)化多重PCR體系、擴(kuò)增條件、雜交條件以及化學(xué)發(fā)光檢測條件后,評價(jià)該芯片的特異性、重復(fù)性和靈敏度。用實(shí)時(shí)熒光PCR法與芯片法分別檢測腸道病毒EV71梯度稀釋的核酸,比較兩種方法的靈敏度。并利用該方法對74例發(fā)熱伴出疹性疾病的實(shí)際臨床樣本進(jìn)行檢測以評價(jià)其實(shí)用性。結(jié)果:完成了九種發(fā)熱伴出疹病原體基因芯片檢測方法的建立。1.根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)的調(diào)研結(jié)果最終確定九種待檢測的病原體:麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腸道病毒71型、登革熱病毒、人類小DNA病毒B19、柯薩奇病毒A16型、A組β型溶血性鏈球菌和傷寒沙門氏菌。共篩選出了11條特異性檢測探針和9對特異性擴(kuò)增引物。2.構(gòu)建了這九種病原體的質(zhì)粒參考品,并成功構(gòu)建了麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型、登革熱病毒這五種RNA病毒的體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品。3.優(yōu)化后的多重PCR體系分為A、B兩管,在優(yōu)化好的多重PCR體系、雜交條件以及檢測條件下,該芯片顯示出良好的重復(fù)性、特異性以及靈敏度。4.質(zhì)粒參考品和體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品的最低檢測限均達(dá)到3×103copies/反應(yīng),芯片法比實(shí)時(shí)熒光PCR法的靈敏度低10倍,但芯片具有明顯的高通量優(yōu)勢。5.74例臨床樣本的檢測靈敏度為95.00%,檢測特異性為100.00%,總符合率為95.95%。結(jié)論:本文建立了一種能同時(shí)檢測九種發(fā)熱伴出疹病原體的化學(xué)發(fā)光檢測基因芯片的方法,并經(jīng)過初步驗(yàn)證該檢測方法具有良好的特異性、重復(fù)性和靈敏度,為發(fā)熱伴出疹的流行病學(xué)研究及其臨床診斷提供了一種高通量、高效率的篩查手段。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R440;R51

【參考文獻(xiàn)】

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