本文關鍵詞：巖藻聚糖硫酸酯的腸吸收及其藥代動力學初步研究　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：巖藻聚糖硫酸酯多來源于褐藻和海洋無脊椎動物中,是一類富含巖藻糖的硫酸雜多糖。目前,關于巖藻聚糖硫酸酯的生物學活性已有廣泛研究,其生物學活性主要包括:抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗血栓、免疫調節(jié)、肝臟及腎臟保護功能。雖然對巖藻聚糖硫酸酯的生物學活性已有較多研究,但巖藻聚糖硫酸酯的口服吸收情況卻鮮有報道。通常認為多糖作為一種大分子物質很難被口服吸收利用,然而,近年來的一些研究表明裙帶菜來源的巖藻聚糖硫酸酯、海蘊來源的巖藻聚糖硫酸酯、茶樹花多糖等大分子多糖均可以通過口服被吸收利用。然而,海帶來源的巖藻聚糖硫酸酯是否能被口服吸收?口服吸收率如何?吸收機制是什么?至今未見報道。我國海帶資源豐富,對海帶來源的巖藻聚糖硫酸酯進行吸收及其藥代動力學研究不僅有利于海帶資源的高值化開發(fā),而且為巖藻聚糖硫酸酯在保健品和藥品中的應用奠定了理論基礎。本實驗采用FITC熒光標記的方式建立了一種新型巖藻聚糖硫酸酯含量測定的方法,然后以FITC-巖藻聚糖硫酸酯為原料,通過單向灌流法在體腸吸收實驗和Caco-2細胞transwell小室模型實驗對巖藻聚糖硫酸酯的吸收情況及其機制進行探討,并對其在大鼠體內的藥代動力學特征進行初步探究,具體研究內容包括以下幾個方面:1、熒光標記巖藻聚糖硫酸酯可以提高含量測定方法的靈敏度和特異性采用FITC將巖藻聚糖硫酸酯標記,提高其檢測的靈敏度和特異性,并用熒光分光光度計和高效液相色譜確證了標記實驗的結果。在熒光標記的基礎上,本實驗利用高效液相色譜,并使用熒光檢測器,建立了外標法和內標法測定巖藻聚糖硫酸酯含量的方法,并分別對其方法學進行了研究,結果表明外標法和內標法測定巖藻聚糖硫酸酯含量的方法均符合中國藥典的規(guī)定,且外標法和內標法的檢測限分別為0.05μg/mL和0.5 μg/mL,可以滿足后續(xù)實驗所需的檢測靈敏度。2、巖藻聚糖硫酸酯可以被腸道吸收分別選取10 cm長度的十二指腸、空腸和回腸,將其兩端剪開一個小口并插管。以0.01 mg/mL、0.1 mg/mL和1 mg/mL三種濃度的巖藻聚糖硫酸酯進行單向灌流,通過檢測流出液中巖藻聚糖硫酸酯的減少量以判斷其在大鼠不同腸段的吸收情況。實驗結果表明,巖藻聚糖硫酸酯在空腸中吸收最好,回腸次之,十二指腸最差,說明巖藻聚糖硫酸酯主要吸收部位為空腸和回腸。另外,高濃度的巖藻聚糖硫酸酯的表觀滲透系數(shù)比低濃度低,存在高濃度抑制現(xiàn)象,說明巖藻聚糖硫酸酯的吸收可能是依賴于載體的轉運。3、巖藻聚糖硫酸酯通過胞吞的形式被Caco-2細胞吸收建立了 Caco-2細胞transwell小室模型,并用TEER電阻儀檢測了細胞模型的緊密性。采用Caco-2細胞transwell小室模型檢測了巖藻聚糖硫酸酯在腸道細胞中的吸收和外排作用,結果表明該藥物在小室模型中吸收量總體較少,但可以檢測到其吸收值,且吸收作用大于外排作用,推斷巖藻聚糖硫酸酯可以通過腸道進入血液循環(huán)。此外,本實驗還通過Caco-2細胞transwell小室模型探究了轉運時間、樣品濃度、轉運溫度以及抑制劑對其吸收的影響。轉運時間對巖藻聚糖硫酸酯吸收的影響實驗,選用30、60、90、120、180、240 min作為吸收研究的時間點,結果表明,在吸收時間達到120min時,表觀滲透系數(shù)達到最大值,其后的吸收過程逐漸趨于平穩(wěn)。樣品濃度對巖藻聚糖硫酸酯的影響實驗,分別研究了0.01 mg/mL、0.1 mg/mL和1 mg/mL三種濃度的巖藻聚糖硫酸酯的轉運情況,結果表明高濃度巖藻聚糖硫酸酯的吸收率明顯低于低濃度巖藻聚糖硫酸酯的吸收率,說明巖藻聚糖硫酸酯的吸收可能是依賴于載體的轉運。轉運溫度對巖藻聚糖硫酸酯吸收的影響實驗,溫度分別選用了 4℃和37℃,實驗結果表明,巖藻聚糖硫酸酯在37℃下可以被腸道吸收,而在4℃條件下,幾乎不被吸收,說明巖藻聚糖硫酸酯的吸收是一個耗能過程。網(wǎng)格蛋白抑制劑對巖藻聚糖硫酸酯吸收的影響實驗,通過加入網(wǎng)格蛋白抑制劑鹽酸氯丙嗪抑制網(wǎng)格蛋白的功能,實驗結果表明,加入抑制劑后巖藻聚糖硫酸酯幾乎沒有被吸收,推測巖藻聚糖硫酸酯可能通過網(wǎng)格蛋白介導的胞吞作用被腸道吸收。4、巖藻聚糖硫酸酯的藥代動力學特征將巖藻聚糖硫酸酯配制成10 mg/mL的樣品溶液,按照大鼠體重給藥,大鼠口服給藥采用灌胃給藥的方式,給藥劑量為20 mg/kg,靜脈給藥采用尾靜脈注射給藥的方式,給藥劑量為6 mg/kg。在口服給藥和靜脈給藥的0、0.5、1、2、3、4、6、12和24h后,將0.3 mL血液從尾靜脈中連續(xù)取出,并收集到具有0.45 mg EDTA的抗凝管中。通過10%的三氯乙酸沉淀蛋白和無水乙醇醇沉多糖的方式對血漿樣品進行含量測定前處理,并采用高效液相色譜內標法檢測巖藻聚糖硫酸酯的含量。結果表明巖藻聚糖硫酸酯在2 右可以達到最高血藥濃度7.33 μg/mL,其口服生物利用度為2.67%。綜上所述,本課題以FITC-巖藻聚糖硫酸酯為原料,通過細胞和動物實驗證明海帶來源的巖藻聚糖硫酸酯可以被腸道吸收,且在細胞層面的吸收作用大于外排作用,其吸收機制可能為依賴于網(wǎng)格蛋白的胞吞作用。藥代動力學實驗表明巖藻聚糖硫酸酯能夠進入血液循環(huán),口服生物利用度為2.67%。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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