本文關鍵詞：SF-1介導四物合劑藥理血清干預順鉑損傷后大鼠卵巢顆粒細胞Cyp19a1活性及表達的研究　出處：《北京中醫(yī)藥大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:卵巢是女性主要生殖器官之一,卵泡的發(fā)育過程中,顆粒細胞和卵泡膜細胞合成的物質(zhì)對其進行調(diào)控。顆粒細胞和卵泡膜細胞的增殖或功能減退可導致卵泡閉鎖增加,從而加速了絕經(jīng)期的到來,即縮短了婦女的生殖期,導致卵巢功能早衰。本研究擬通過細胞實驗,以順鉑(cis-Diaminedichloroplatinum,CDDP)作為卵巢顆粒細胞損傷因素建立化療源性卵巢顆粒細胞損傷模型,觀測四物合劑藥理血清對損傷后顆粒細胞分泌E2水平、E2合成關鍵酶Cyp19al基因表達水平及其基因表達調(diào)控通路TGF-β3—Smad3—SF-1的影響,明確四物合劑藥理血清對順鉑損傷后卵巢顆粒細胞E2分泌功能的作用效果,揭示其作用機制,從而為四物合劑在臨床上用于卵巢早衰的治療提供實驗依據(jù)。方法:1.四物合劑藥理血清干預順鉑損傷后顆粒細胞中Cyp19al活性及表達卵巢顆粒細胞是卵巢雌激素合成分泌的主要細胞,通過放免法測定細胞培養(yǎng)過程中上清液E2水平,觀察順鉑損傷后下和四物合劑藥理血清的干預后顆粒細胞分泌E2水平的變化,明確四物合劑藥理血清干預順鉑損傷后的卵巢顆粒細胞中Cyp19al活性的作用。E2合成原料為膽固醇,在一系列酶作用下合成雄烯二酮(Androstenedione)轉(zhuǎn)運至顆粒細胞,顆粒細胞中的芳香化酶(Aromatase,Cyp19al)和17β-類固醇脫氫酶(17β-Hydroxysteroid dehydrogenase,17 β-HSD)以雄烯二酮為底物催化生成 E2,其中Cyp19al是E2合成過程及其重要的限速酶。因此本實驗通過蛋白印跡和RT-PCR從蛋白質(zhì)和mRNA水平觀察四物合劑干預后順鉑損傷后下的顆粒細胞中Cyp19al的表達變化,從而了解四物合劑影響顆粒細胞E2分泌的機制。2.四物合劑藥理血清對SF-1激活Cyp19al基因啟動子的干預效果Smad3與SF-1共同作用從而促進SF-1與Cyp19al的PII區(qū)域結(jié)合來調(diào)節(jié)Cyp19al的表達。利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗,觀察四物合劑藥理血清對SF-1激活CyP19al基因啟動子的干預效果,實驗以SF-1抗體結(jié)合顆粒細胞的內(nèi)源性SF-1蛋白,因SF-1蛋白與Cyp19al PII啟動子結(jié)合,因而在用微珠結(jié)合SF-1抗體時可將Cyp19al PII片段提出,經(jīng)超聲斷裂后以PCR凝膠電泳檢測CyP19al PII的含量,即可了解各組細胞中SF-1啟動Cyp19al表達的效果。通過免疫共沉淀實驗(CoIP),以SF-1抗體作為免疫共沉淀抗體,Smad3抗體作為免疫印記抗體,通過觀察經(jīng)SF-1特異性沉淀得到的Smad3水平的變化,了解四物合劑藥理血清對干預順鉑損傷后的大鼠卵巢顆粒細胞中,Smad3與SF-1結(jié)合從而增強SF-1激活Cyp19al基因啟動子的影響效果。3.四物合劑藥理血清通過TGF-β3通路干預順鉑損傷后顆粒細胞Cyp19al的活性及表達TGF-p3與受體結(jié)合后通過募集并磷酸激活下游的Smad2或Smad3,被激活的Smad3與Co-Smad4結(jié)合形成復合體,復合體向核內(nèi)轉(zhuǎn)運,調(diào)控某些基因的表達,Cyp19al即為其靶基因之一。經(jīng)TGF-β3活化后的Smad3(p-Smad3)入核后,通過其MH2結(jié)構域介導與轉(zhuǎn)錄因子類固醇生成因子1(Steroidogenic factor 1,SF-1)的相互作用,增強SF-1與Cyp19al啟動子的結(jié)合提高其轉(zhuǎn)錄活性,進而促進Cyp19al的表達和E2的分泌。實驗在藥理血清干預過程中加入外源性TGF-β3細胞因子刺激顆粒細胞,或加入Smad蛋白阻斷劑SB431542阻斷Smad蛋白磷酸化,觀察四物合劑藥理血清對順鉑損傷后的大鼠卵巢顆粒細胞中Cyp19al活性及表達的干預效果。首先,放免法檢測各組細胞E2分泌水平,明確四物合劑藥理血清通過TGF-β3信號通路干預順鉑損傷后大鼠卵巢顆粒細胞中E2分泌的影響;其次,免疫組化法檢測四物合劑藥理血清干預順鉑損傷后各組顆粒細胞中Cyp19al表達,明確四物合劑藥理血清干預順鉑損傷后顆粒細胞中Cyp19al的活性及表達與TGF-p3信號通路的關系。結(jié)果:1.放射性免疫法檢測各組顆粒細胞上清液中E2水平,順鉑組顆粒細胞E2分泌水平下降,與順鉑組相比,四物合劑藥理血清干預后,細胞中上清液中E2水平明顯上升;Western Blot、RT-PCR結(jié)果顯示四物合劑藥理血清組Cyp19al蛋白、mRNA表達水平高于順鉑模型組;2.ChIP實驗結(jié)果顯示,順鉑模型組Cyp19al PⅡ相對表達水平最低,四物合劑干預后Cyp19al PⅡ相對表達水平升高。CoIP實驗結(jié)果顯示,與順鉑模型組相比,四物合劑組Smad3相對表達水平明顯升高;3.加入外源性TGF-β3刺激顆粒細胞后,與未加入TGF-β3時比較,四物合劑藥理血清干預的順鉑損傷后顆粒細胞E2分泌水平上升,而加入阻斷劑后,四物合劑藥理血清干預順鉑損傷后顆粒細胞E2分泌水平下降;免疫組化結(jié)果顯示,TGF-β3組Cyp19al在蛋白質(zhì)水平上表達高于未加TGF-β3組,而在加入阻斷劑后,四物合劑藥理血清干預的順鉑損傷后顆粒細胞中Cyp19al表達水平下降。結(jié)論:1.四物合劑藥理血清可干預Cyp19al基因表達而促進順鉑損傷后的大鼠卵巢顆粒細胞E2分泌。2.四物合劑藥理血清能促進順鉑損傷后的大鼠卵巢顆粒細胞中SF-1激活Cyp19al基因啟動子的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)Cyp19al表達,且促進了 Smad3與SF-1協(xié)同作用影響Cyp19al基因的轉(zhuǎn)錄。3.四物合劑藥理血清能影響TGF-β3調(diào)節(jié)其靶基因Cyp19al的活性與表達,這一過程可能與TGF-β3—Smad3—SF-1信號轉(zhuǎn)導通路有關。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 阮凡;石吟;李麗潔;;中藥補腎養(yǎng)血方聯(lián)合激素替代法對卵巢早衰患者性激素水平及癥狀評分的影響[J];中國生化藥物雜志;2016年12期

2 孟s，

本文編號：1310245