本文關(guān)鍵詞：雙氫青蒿素抑制肝星狀細(xì)胞收縮發(fā)揮抗肝纖維化門脈高壓作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：[背景]門靜脈高壓是繼發(fā)于肝纖維化及肝硬化最常見的并發(fā)癥之一。當(dāng)前研究表明,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)活化收縮是促使門靜脈高壓形成的主要誘導(dǎo)因素。肝損傷時(shí),HSC受一系列刺激因子誘導(dǎo)而活化,獲得強(qiáng)烈的收縮能力,通過收縮擠壓肝竇、促進(jìn)瘢痕組織攣縮進(jìn)而增加肝內(nèi)血管阻力,最終誘導(dǎo)門靜脈高壓的形成,因此,靶向抑制HSC活化收縮成為治療門靜脈高壓的新策略。挖掘靶向抑制HSC收縮進(jìn)而緩解門靜脈高壓的高效無毒的藥物是目前抗肝纖維化門靜脈高壓領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本課題組的前期研究結(jié)果表明,天然產(chǎn)物青蒿素衍生物雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)具有確切的抗肝纖維化療效。DHA可有效抑制HSC活化并誘導(dǎo)其凋亡,從而減緩肝臟纖維化形成及發(fā)展,這一系列結(jié)果揭示了 DHA在抗肝纖維化門脈高壓中的應(yīng)用潛能,但具體的療效和作用機(jī)制仍有待深入探討。大量研究提示,法尼酯衍生物X受體(farnesoidXreceptor,FXR)和鞘氨醇-1-磷酸受體 2(sphingosine-l-phosphatereceptor2,S1PR2)在 HSC 收縮及門靜脈高壓的調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。本研究旨在明確DHA對肝纖維化門脈高壓的治療作用,并闡明其作用的分子機(jī)理。本研究的結(jié)果為開發(fā)DHA作為抗肝纖維化門脈高壓藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為DHA的作用機(jī)理研究提供全新的思路和明確的方向。[方法]1、臨床樣本檢測自南京鼓樓醫(yī)院腫瘤科隨機(jī)選取4例臨床肝癌患者癌組織和癌旁組織樣本。以免疫熒光雙染法考察肝癌患者癌組織和癌旁組織中HSC內(nèi)FXR表達(dá)。2、體外研究選取永生化人肝星狀細(xì)胞LX-2細(xì)胞株作為本論文體外研究對象。以鼠尾膠原凝膠收縮實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞骨架染色實(shí)驗(yàn)評估HSC收縮能力,以鈣離子(calcium,Ca~(2+))熒光探針檢測HSC內(nèi)Ca~(2+)含量。Real-time PCR法、免疫熒光染色法及Western blot法用于檢測HSC內(nèi)目的基因及蛋白的豐度。3、體內(nèi)研究將48只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成6組(每組8只):正常對照組、CCl_4模型組、DHA治療組、奧貝膽酸(obeticholicacid,OCA)治療組、DHA及OCA聯(lián)合治療組、DHA及沒藥甾酮(Z-guggulsterone,ZGGS)聯(lián)合治療組。以蘇木精-伊紅染色法和掃描電鏡觀察大鼠肝臟微觀結(jié)構(gòu),以免疫組織化學(xué)染色法觀察大鼠肝臟中促炎性因子表達(dá)情況,以天狼星紅染色和Masson三色染色法定性評估大鼠肝臟中膠原纖維含量,以羥脯氨酸測定法定量評估大鼠肝臟中膠原特異性氨基酸的含量,以試劑盒檢測大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶的含量,以酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測大鼠血清中干擾素γ、腫瘤壞死因子0α、白介素6、透明質(zhì)酸、層黏連蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原和轉(zhuǎn)化生長因子β的含量,經(jīng)門靜脈和頸動(dòng)脈插管檢測大鼠門靜脈壓和平均動(dòng)脈壓,以Real-time PCR法、免疫熒光染色法及Western blot法檢測大鼠肝組織中目的基因和蛋白的豐度。[結(jié)果]臨床肝臟樣本的免疫熒光染色結(jié)果顯示,相較于癌旁組織,癌組織中HSC內(nèi)FXR熒光強(qiáng)度顯著下降,且FXR表達(dá)隨HSC活化標(biāo)志物增加而逐漸降低,表明HSC內(nèi)FXR表達(dá)與HSC活化程度呈顯著的負(fù)相關(guān)性。體外研究結(jié)果顯示,DHA以劑量依賴性及時(shí)間依賴性的方式增加HSC中FXR的mRNA及蛋白的豐度。同時(shí)DHA可抑制HSC中促纖維化相關(guān)基因的表達(dá),暗示DHA對HSC生物學(xué)行為具有一定的調(diào)控作用。凝膠收縮實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示,DHA可劑量依賴性地減少HSC內(nèi)肌動(dòng)蛋白絲的形成并抑制骨架重構(gòu),從而削弱HSC的收縮能力。DHA可降低肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),DHA對HSC活化收縮的抑制作用是依賴于HSC內(nèi)FXR活化的。接下來的結(jié)果顯示,S1PR2介導(dǎo)的Ca~(2+)依賴和Ca~(2+)敏感信號途徑是觸發(fā)HSC收縮的關(guān)鍵信號途徑。激活FXR進(jìn)而抑制S1PR2介導(dǎo)的Ca~(2+)依賴和Ca~(2+)敏感信號途徑是DHA抑制HSC收縮的分子基礎(chǔ)。體內(nèi)研究結(jié)果顯示,相較于正常對照組,CCl_4模型組大鼠肝臟HSC中FXR熒光強(qiáng)度顯著下降而α-SMA熒光強(qiáng)度增加,而DHA及OCA可明顯增強(qiáng)大鼠HSC內(nèi)FXR熒光強(qiáng)度,同時(shí)降低α-SMA熒光強(qiáng)度。血清學(xué)檢測和形態(tài)學(xué)分析結(jié)果一致表明,DHA對CCl_4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷、炎性介質(zhì)表達(dá)及炎細(xì)胞浸潤有顯著的改善作用。這一系列作用可被OCA進(jìn)一步增強(qiáng),或被ZGGS削弱。DHA和OCA均可明顯降低大鼠門靜脈壓力及肝臟中纖維形成。機(jī)制研究表明,抑制HSC活化收縮是DHA抗肝纖維化門脈高壓作用的基礎(chǔ)。[結(jié)論]本研究中,臨床標(biāo)本檢驗(yàn)結(jié)果表明,FXR表達(dá)與HSC活化程度呈負(fù)性相關(guān)。體外部分結(jié)果表明,DHA可通過調(diào)控FXR/S1PR2信號軸進(jìn)而抑制Ca~(2+)依賴和Ca~(2+)敏感信號介導(dǎo)的HSC收縮。體內(nèi)部分結(jié)果表明,DHA具有確切的改善CCl_4誘導(dǎo)的肝損傷、炎癥及肝纖維化門脈高壓的作用,且這一作用與DHA抑制HSC活化收縮密切相關(guān)。DHA對HSC活化收縮的抑制作用主要依賴于其對HSC內(nèi)FXR的激活作用。本研究為靶向調(diào)控FXR的抗肝纖維化門脈高壓藥物的開發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2

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本文編號：1305367