發(fā)布時間：2017-12-18 19:08

  本文關(guān)鍵詞：hTNF-α抗體的制備及人鼠嵌合型基因工程抗體的研究

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【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種主要表現(xiàn)為軟骨和骨損傷的慢性自身免疫性疾病,全球發(fā)病率高達0.24%,嚴(yán)重威脅人類的健康。雖然RA的發(fā)病機制還不是完全清楚,但是研究者發(fā)現(xiàn)遺傳、環(huán)境、免疫調(diào)節(jié)異常等因素與它有關(guān)。其中,免疫調(diào)節(jié)異常與RA的關(guān)系廣受關(guān)注。引發(fā)和維持介質(zhì)與調(diào)停介質(zhì)的不平衡是引起免疫調(diào)節(jié)異常的重要原因,這將導(dǎo)致炎癥不受機體控制,進而引發(fā)細胞損傷。在RA個體中,這種損傷表現(xiàn)為滑膜、軟骨、骨的破壞。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的分泌異常是導(dǎo)致兩種介質(zhì)處于不平衡狀態(tài)、引起免疫調(diào)節(jié)異常并引發(fā)RA的重要因素之一,因此受到研究者的廣泛關(guān)注。TNF-α是一種來源廣泛的、具有高度保守性的細胞因子,通過刺激多種細胞來發(fā)揮不同的功能。TNF-α抑制劑能夠特異性結(jié)合TNF-α,阻斷其生物活性,進而控制炎癥、緩解病情,已在臨床上廣泛應(yīng)用。比如英夫利昔單抗、阿達木單抗和依那西普等,但是,由于上述單抗成本高、價格昂貴、操作復(fù)雜和免疫排斥等因素限制了它們的應(yīng)用。因此,需要開發(fā)一種成本較低、操作簡單和免疫耐受的TNF-α抑制劑。為了開發(fā)一種TNF-α抑制劑,本課題通過以人源TNF-α為抗原免疫Balb/c小鼠,制備抗TNF-α的鼠源單克隆抗體。為降低機體對該抗體的免疫排斥,對該抗體進行人源化改造,最終獲得一株嵌合型抗體,為后續(xù)開發(fā)有效的TNF-α抑制劑打下基礎(chǔ)。首先,用hTNF-α免疫雌性Balb/c小鼠,通過單克隆抗體技術(shù)獲得了八株分泌特異性結(jié)合hTNF-α的單克隆抗體的雜交瘤細胞,經(jīng)染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)量的驗證,均符合雜交瘤細胞的特征。對單抗亞型鑒定的結(jié)果顯示,制備的單抗是IgMκ亞型。挑選其中三株用于制備腹水,用特異性結(jié)合免疫球蛋白κ輕鏈的Protein L對腹水進行純化。通過BCA法測得純化后的抗體濃度為2 mg/ml。SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示純化后的單抗純度較高,Western blot檢測結(jié)果驗證了單克隆抗體為IgM亞型。為了挑選一株合適的雜交瘤細胞株用于后續(xù)的基因工程改造,對純化后的三株單抗進行了親和力的測定,通過非競爭ELISA法測定單克隆抗體親和力,最終計算得到2B9E10單抗的Ka = 1.6×108 M-1、3E4C11單抗的Ka =7.698×108 M-1、4H5A10 單抗的 Ka = 5.9×107M-1,細胞株 2B9E10 和 3E4C11 細胞株所分泌的抗體屬于高親和力抗體。故挑選親和力最高的3E4C11單抗進行基因工程改造。其次,用通用引物調(diào)取3E4C11細胞株的輕、重鏈可變區(qū)基因,經(jīng)過SOEPCR將可變區(qū)基因以交聯(lián)臂(Gly4Ser)3連接,構(gòu)成單鏈抗體(ScFv),將其與人源IgG1 Fc段基因序列相連,構(gòu)建到真核表達載體中。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到293T細胞中進行表達,最終Western blot結(jié)果顯示在胞漿中檢測到目的蛋白的表達。通過本課題的研究,我們不僅自主研制出了特異性結(jié)合hTNF-α的鼠源性單克隆抗體,并對其進行基因工程改造,獲得嵌合型抗體,這為更進一步的人源化改造打下基礎(chǔ),且在TNF-α抑制劑的開發(fā)以及RA的治療方面具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉國奇,王海濤;外源蛋白在中國倉鼠卵巢細胞中高效表達的策略[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2000年05期

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本文編號：1305280