本文關(guān)鍵詞：基于血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究刮痧干預(yù)腰椎間盤突出癥的效應(yīng)機(jī)制

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【摘要】：目的:(1)運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù),研究刮痧對(duì)腰椎間盤突出癥(Lumbar disc herniation,LDH)模型大鼠血清炎性細(xì)胞因子的影響。(2)運(yùn)用血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),研究刮痧對(duì)LDH模型大鼠血清差異蛋白表達(dá)的影響,從整體角度研究刮痧干預(yù)LDH的作用機(jī)制。方法:(1)將72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、刮痧組,每組24只。模型組與刮痧組大鼠建立自體髓核移植非壓迫性LDH模型,假手術(shù)組同樣暴露右側(cè)L5DRG,切斷尾椎,但不做放置髓核處理。模型組與假手術(shù)組不予治療,刮痧組于造模后第5天開始干預(yù),隔日刮一次,3次為一個(gè)療程,共刮3個(gè)療程。分別于造模后刮痧前、第1療程結(jié)束、第2療程結(jié)束、第3療程結(jié)束,共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察各組大鼠痛閾,并收集大鼠外周血。每組每次隨機(jī)取6只大鼠。ELISA檢測(cè)大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β),白細(xì)胞介素4(IL-4),白細(xì)胞介素6(IL-6),干擾素γ(IFN-γ),腫瘤壞死因子α(TNF-α)。(2)收集LDH模型組與刮痧組大鼠部分血清樣本,分別為模型組1個(gè)療程、模型組2個(gè)療程、模型組3個(gè)療程、刮痧組1個(gè)療程、刮痧組2個(gè)療程、刮痧組3個(gè)療程,共6組,每組各6個(gè)樣本。運(yùn)用iTRAQ技術(shù),探究分別在3個(gè)療程中與刮痧干預(yù)相關(guān)的蛋白,進(jìn)行包括分子功能、細(xì)胞組分與生物過程的GO(Gene Ontology)分析,運(yùn)用IPA(Ingenuity(?)Pathway Analysis)數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白的重要信號(hào)通路和相互作用的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果:(1)干預(yù)3個(gè)療程后,與模型組比較,刮痧能升高LDH大鼠熱痛閾值(P0.05),顯著降低血清IL-1β、IL-6、TNF-α與IFN-γ水平(P0.05),而對(duì)IL-4水平無顯著影響(P0.05);IFN-γ/IL-4水平與大鼠熱痛閾值呈負(fù)相關(guān),刮痧可明顯降低其水平。(2)①干預(yù)1個(gè)療程后,刮痧組與模型組相比共鑒定出198個(gè)差異蛋白。GO分析共鑒定出10個(gè)分子功能,13個(gè)細(xì)胞組分和19個(gè)生物過程。在分子功能中排前三位的分別是結(jié)合(48%)、催化活性(22%)、分子功能調(diào)節(jié)(5%);在細(xì)胞組分中排名前三位的分別是細(xì)胞成分(28%)、細(xì)胞器(18%)、細(xì)胞器成分(14%);在生物過程中排名前三位的分別是細(xì)胞進(jìn)程(19%)、生物調(diào)節(jié)(15%)、單生物過程(15%)。IPA分析共鑒定出306條信號(hào)通路,富集度較高的前10條信號(hào)通路分別為:FAK Signaling、Regulation of eIF4 and p70S6K Signaling、Actin Cytoskeleton Signaling、PI3K/AKT Signaling、Erythropoietin Signaling、IL-3 Signaling、LPS-stimulated MAPK Signaling、ERK/MAPK Signaling、Cancer Drug Resistance By Drug Efflux 和 Semaphorin Signaling in Neurons。差異蛋白主要涉及18個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。②干預(yù)2個(gè)療程后,刮痧組與模型組相比共鑒定出182個(gè)差異蛋白。GO分析共鑒定出11個(gè)分子功能,13個(gè)細(xì)胞組分和20個(gè)生物過程。在分子功能中排前三位的分別是結(jié)合(44%)、催化活性(21%)、分子功能調(diào)節(jié)(9%);在細(xì)胞組分中排名前三位的分別是細(xì)胞成分(27%)、細(xì)胞器(18%)、細(xì)胞器成分(13%);在生物過程中排名前三位的分別是細(xì)胞進(jìn)程(16%)、生物調(diào)節(jié)(15%)、單生物過程(14%)。IPA分析共鑒定出245條信號(hào)通路,富集度較高的前10條信號(hào)通路分別為:Acute Phase Response Signaling、LXR/RXR Activation、Intrinsic Prothrombin Activation Pathway、Actin Cytoskeleton Signaling、FXR/RXR Activation、Lanosterol Biosynthesis、Ubiquinol-10 Biosynthesis(Eukaryotic)、Rac Signaling、Regulation of the Epithelial-Mesenchymal Transition Pathway 和Clathrin-mediated Endocytosis Signaling。差異蛋白主要涉及 13 個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。③干預(yù)3個(gè)療程后,刮痧組與模型組相比共鑒定出170個(gè)差異蛋白。GO分析共鑒定出10個(gè)分子功能,15個(gè)細(xì)胞組分和18個(gè)生物過程。在分子功能中排前三位的分別是結(jié)合(45%)、催化活性(25%)、分子功能調(diào)節(jié)(6%);在細(xì)胞組分中排名前三位的分別是細(xì)胞成分(27%)、細(xì)胞器(18%)、細(xì)胞器成分(13%);在生物過程中排名前三位的分別是細(xì)胞進(jìn)程(20%)、生物調(diào)節(jié)(16%)、單生物過程(15%)。IPA分析共鑒定出245條信號(hào)通路,富集度較高的前10條信號(hào)通路分別為:LXR/RXRActivation、FXR/RXR Activation、5-aminoimidazole Ribonucleotide Biosynthesis I、Inhibition of Angiogenesis by TSP1、Melatonin Degradation II、tRNA Charging、Tetrahydrofolate Salvage from 5,10-methenyltetrahydrofolate、Tyrosine Degradation I、Serotonin Receptor Signaling 和Ceramide Biosynthesis。差異蛋白主要涉及13個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)論:(1)刮痧能抑制自體髓核引起的LDH大鼠血清促炎因子,并抑制機(jī)體Thl免疫,使機(jī)體Thl/Th2免疫失衡恢復(fù)到正常狀態(tài),從而減輕其疼痛。(2)刮痧干預(yù)后,LDH大鼠血清中眾多蛋白的表達(dá)發(fā)生了改變,這些蛋白涉及眾多功能,說明機(jī)體發(fā)生了廣泛而復(fù)雜的變化。刮痧不僅可以調(diào)控與LDH相關(guān)的病理變化過程,亦可通過刺激生理變化過程達(dá)到治療效果。不同的蛋白可能先后激活不同的通路來誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng),起到治療效果,其中最主要的三條通路為:FAK Signaling、Acute Phase Response Signaling 和 LXR/RXR Activation。此外,刮痧可能通過調(diào)節(jié) ERK1/2、NFκB 等信號(hào)通路,從而參與了細(xì)胞形態(tài)與器官形態(tài)、機(jī)體損傷與異常、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與功能等信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。信號(hào)通路與網(wǎng)絡(luò)分析提示差異蛋白主要參與炎癥免疫、神經(jīng)保護(hù)、維持細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)平衡過程,Racl、Orml、Hpx、Gapdh、Hsp70、Htt等蛋白在這些過程中發(fā)揮了重要作用,可能作為潛在的靶點(diǎn)蛋白,為解釋刮痧治療LDH效應(yīng)機(jī)制方面提供新的思路和依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R244.4

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