發(fā)布時(shí)間：2017-12-16 23:09

  本文關(guān)鍵詞：STAT1在HBV對(duì)IFN-α產(chǎn)生耐藥中的作用

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【摘要】：乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒,它可以導(dǎo)致慢性乙型肝炎,嚴(yán)重危害人類健康。干擾素(IFN)類和核苷酸類被廣泛運(yùn)用于臨床。然而,慢性乙型肝炎的治療是一個(gè)長期過程,在用IFN-α治療時(shí),隨著時(shí)間的延長和用藥次數(shù)的增加,HBV對(duì)IFN-α的敏感性會(huì)下降,使得IFN-α抗HBV作用減弱。大量臨床研究也發(fā)現(xiàn),乙型肝炎患者在長期運(yùn)用IFN-α治療時(shí),很容易導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn),這為乙型肝炎的治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。IFN-α主要通過JAK-STAT信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒作用,而信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)在這個(gè)通路中發(fā)揮重要作用。研究表明,STAT1的表達(dá)及其修飾影響IFN-α抗HBV活性。因此,研究STAT1的變化及其相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)情況,對(duì)于研究IFN-α治療HBV有著重要意義。Hep G2.2.15細(xì)胞是抗HBV新藥開發(fā)的一個(gè)良好的體外研究工具,它能夠在體外進(jìn)行無性繁殖,并能長期穩(wěn)定分泌HBs Ag,、HBe Ag和Dane顆粒,是體外篩選抗HBV藥物的良好模型。本課題組通過小劑量IFNα-2b(50 IU/ml)長期(6個(gè)月)不斷刺激Hep G2.2.15細(xì)胞,建立耐IFNα-2b的Hep G2.2.15細(xì)胞模型。耐藥細(xì)胞株對(duì)IFNα-2b敏感性降低,對(duì)HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA的抑制作用明顯減弱。本課題組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探究Hep G2.2.15細(xì)胞、Hep G2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1與耐藥的關(guān)系及可能的作用機(jī)制。目的通過小劑量IFNα-2b(50 IU/ml)長期(6個(gè)月)不斷刺激HepG2.2.15細(xì)胞,建立耐IFNα-2b的Hep G2.2.15細(xì)胞模型——Hep G2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞,探究Hep G2.2.15細(xì)胞,Hep G2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1與耐藥的關(guān)系及可能的作用機(jī)制。方法1.實(shí)驗(yàn)采用Western blot法分別檢測不同濃度(0,250,500,1 000 IU/ml)IFNα-2b作用72 h,對(duì)照組細(xì)胞、3個(gè)月刺激組細(xì)胞以及6個(gè)月刺激組細(xì)胞p-STAT1、STAT1蛋白表達(dá)情況,并探討p-STAT1/STAT1的差異。2.以Hep G2.2.15細(xì)胞為對(duì)照組細(xì)胞,Hep G2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞為模型組細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞和模型組細(xì)胞相同數(shù)目下培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞上清液,采用ELISA法檢測其HBs Ag、HBe Ag的量,PCR-熒光探針法檢測HBV DNA量。探討Hep G2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA的表達(dá)量變化。3.以Hep G2.2.15細(xì)胞為對(duì)照組細(xì)胞,Hep G2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞為模型組細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞和模型組細(xì)胞相同數(shù)目下分別給予0,IFNα-2b(1 000 IU/ml)作用24 h,分別和不給藥組比較,采用ELISA法檢測其HBs Ag、HBe Ag的量;采用PCR-熒光探針法檢測HBV DNA的量;采用Western-blot檢測STAT1、p-STAT1、OAS1蛋白表達(dá)情況,采用q RT-PCR檢測法檢測STAT1、OAS1、USP18的m RNA表達(dá)情況。探討IFNα-2b對(duì)Hep G2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞抗HBV活性變化。4.以Hep G2.2.15細(xì)胞為對(duì)照組細(xì)胞,Hep G2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞為模型組細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞和模型組細(xì)胞相同數(shù)目下分別給予0,IFNα-2b(1 000 IU/ml),IFNα-2b(1 000 IU/ml)+JAK抑制劑(1μM),IFNα-2b(1 000 IU/ml)+TSA(30 nmol/ml),IFNα-2b(1 000 IU/ml)+JAK抑制劑(1μM)+TSA(30 nmol/ml)24 h,采用ELISA法檢測其HBs Ag、HBe Ag的量;采用PCR-熒光探針法檢測HBV DNA的量,采用Western-blot檢測p-STAT1、STAT1、OAS1蛋白表達(dá)情況,采用q RT-PCR檢測法檢測STAT1、OAS1、USP18的m RNA表達(dá)。通過JAK抑制劑、HDACi影響JAK-STAT通路中STAT1的磷酸化和乙�；�,觀察IFNα-2b抗HBV活性變化。探討JAK抑制劑、組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)對(duì)Hep G2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞IFNα-2b抗HBV活性的影響。結(jié)果1.小劑量IFNα-2b(50 IU/ml)刺激6個(gè)月的細(xì)胞在給予不同濃度的IFNα-2b后,和對(duì)照組細(xì)胞比較,STAT1蛋白表達(dá)上調(diào),p-STAT1蛋白表達(dá)下調(diào),且p-STAT1/STAT1下降明顯。2.模型組細(xì)胞分泌HBs Ag、HBe Ag量較對(duì)照組輕微增加,HBV DNA量降低,但均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.在給予IFNα-2b作用后,IFNα-2b對(duì)模型組細(xì)胞的HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA抑制作用降低。與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞STAT1蛋白表達(dá)增多,但磷酸化的STAT1表達(dá)下調(diào),同時(shí),磷酸化的STAT1占STAT1比例降低。STAT1、USP18的m RNA水平上調(diào),OAS1 m RNA水平下調(diào)。4.JAK抑制劑、HDACi對(duì)對(duì)照組細(xì)胞和模型組細(xì)胞IFNα-2b抗HBV活性有著不同程度上的影響。JAK抑制劑、HDACi對(duì)對(duì)照組的影響程度大于模型組細(xì)胞。結(jié)論1.長期小劑量IFNα-2b刺激Hep G2.2.15細(xì)胞后,細(xì)胞對(duì)IFNα-2b敏感性降低,表現(xiàn)為IFNα-2b對(duì)HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA抑制作用的減弱。2.JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1的磷酸化水平下調(diào),是導(dǎo)致HBV對(duì)IFN-α產(chǎn)生耐藥的部分原因。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 ;Effect of oxymatrine on the replication cycle of hepatitis B virus in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2010年16期

2 Padmaja Gade;Dhan V.Kalvakolanu;;The Interferon Signaling Network and Transcription Factor C/EBP-β[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年06期

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本文編號(hào)：1297812