本文關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪肝病的血清miRNA差異表達譜的初步研究

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【摘要】：第一部分:NAFLD血清miRNA表達譜的篩選目的:本研究擬通過采用高通量測序技術(shù)對非酒精性脂肪肝病(NAFLD)患者和正常人血清(CTL)miRNA的差異表達譜進行分析,以期篩選出NAFLD血清特異性miRNA。方法:(1)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的血清采集操作,收集23例臨床確診為NAFLD患者外周血血清和23例體檢健康的正常人的外周血血清標(biāo)本,控制兩組樣本的年齡、性別構(gòu)成比基本匹配,所有患者和志愿者均知情同意并簽署知情同意書;(2)從中選取性別、年齡、種族、吸煙史和飲酒史相近的3例NAFLD和3例CTL血清標(biāo)本作為篩選對象,其余標(biāo)本用于后續(xù)驗證實驗。(3)使用Trizol法提取兩組血清標(biāo)本的總RNA,并且用Nanodrop2000分光光度儀測定RNA的純度和濃度,進行RNA質(zhì)檢。(4)文庫構(gòu)建,采用Illumina高通量測序法對兩組血清標(biāo)本總RNA測序(5)通過比對miRBase數(shù)據(jù)庫中miRNA前體和成熟序列,鑒別篩選出NAFLD的差異表達miRNA。結(jié)果:(1)Illumina高通量測序以及miRBase數(shù)據(jù)比對后,在NAFLD組和CTL組共發(fā)現(xiàn)129條有差異顯著性的miRNA(P0.05),其中表達上調(diào)的有103條,表達下調(diào)的有26條。已知的有125條,新發(fā)現(xiàn)的4條miRNA是:hsa-miR-1357-p3,hsa-miR-1237-p5,hsa-miR-1246-3-p5和hsa-miR-8564-p3。(2)進一步依據(jù)表達差異倍數(shù)"g2,p0.05的標(biāo)準(zhǔn),從這125條已知序列的miRNA篩選出4條差異表達的miRNA:hsa-miR-122-5p,hsa-miR-1290,hsa-miR-192-5p和hsa-miR-130a。其中表達差異最為明顯的是hsa-mi R-122-5p,上升倍數(shù)7.26,其次是hsa-miR-1290和hsa-miR-192-5p,倍數(shù)在4.21和3.01。hsa-miR-130a是唯一的下調(diào)miRNA,差異倍數(shù)2.54。結(jié)論:nafld與ctl的血清中存在顯著性差異的mirna表達譜,這些mirna可能與nafld的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。第二部分:mirna差異表達譜的驗證目的:擬通過實時熒光定量pcr的方法對mirna表達譜進行實驗驗證,以評估初篩的mirna表達譜的可靠性。方法:(1)用rna提取試劑盒提取已收集的20例nafld組和20例ctl組的血清中rna,采用nanodrop2000分光光度儀測定rna的純度和濃度(2)進行mirna逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cdna,最后進行qrt-pcr來驗證這4個mirna(hsa-mir-122-5p,hsa-mir-1290,hsa-mir-192-5p,hsa-mir-130a)表達水平。結(jié)果:與ctl組相比,nafld組hsa-mir-122-5p升高8.25倍,hsa-mir-1290升高3.14倍,hsa-mir-192-5p升高3.58倍,hsa-mir-130a下降2.13倍。結(jié)論:差異表達的hsa-mir-122-5p,hsa-mir-1290,hsa-mir-192-5p,hsa-mir-130a這4個mirna進行qrt-pcr后其表達水平與illumina高通量測序結(jié)果基本相符。表明nafld患者外周血中存在特異性表達的mirna,以上4個mirna很可能與nafld的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。第三部分:mirna差異表達譜的靶基因預(yù)測與分析目的:通過對mirna表達譜的那基因預(yù)測及其相關(guān)功能分析分析,初步探究血清mirnas表達譜對nafld的影響機制。方法:對已經(jīng)驗證過的4個差異表達mirna(hsa-mir-122-5p,hsa-mir-1290,hsa-mir-192-5p,hsa-mir-130a)進行靶基因預(yù)測(軟件targetscan,pictar,miranda),go注釋、bingo富集和kegg信號通路分析。結(jié)果:go注釋的靶基因功能顯示主要集中在分子功能、細(xì)胞成分和生物過程上;kegg通路分析靶基因作用于癌癥中的通路(pathwaysincancer),mapk通路(mapksignalingpathway),調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架中的通路(regulationofactincytoskeleton),焦點粘連(focaladhesion),胰島素信號通路(insulinsignalingpathway),wnt信號通路(wntsignalingpathway)等等。結(jié)論:初步預(yù)測經(jīng)驗證的篩選差異表達miRNA所作用的靶基因,分析所得這些miRNA可能對NAFLD的分子功能、細(xì)胞成分和生物過程產(chǎn)生一定的作用,其分子機制可能通過胰島素信號通路,MAPK信號通路,Wnt信號通路等分子信號通路來調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575

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本文編號：1293657