本文關鍵詞：巨噬細胞中IL-6組蛋白乙�；{控及其在PQ所致肺纖維化中的作用

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【摘要】：研究背景與目的肺纖維化是一種慢性、進行性的肺間質的炎癥性疾病,其發(fā)生率為萬分之一,自確診后五年生存率僅為30%-50%[1-3]。這一疾病的主要病理學改變是肺間質中細胞增殖以及細胞外基質(ECM extrace1lular matrix)過量沉積[2,4]。疾病發(fā)生機制尚不明確,但已有研究表明炎癥、上皮細胞的損傷、凋亡尤其是上皮間質轉換(EMT,epithelial-mesenchymal transition)可能在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著舉足輕重的作用[5-8]。上皮細胞向間質細胞轉化的過程稱之為上皮間質轉化,其特征性改變是細胞上皮特征的逐漸消失(例如:細胞間相互連接,較強的頂膜面-基底膜面極性),而間質特性的愈益增強(例如:ECM復合物的產生、遷移和侵襲的能力)。另外,在EMT的過程中,間質細胞的標記物如α-SMA和波形蛋白都是高表達的,而上皮細胞標記物E-鈣黏素和細胞角蛋白卻是低表達的[6,9-11]。百草枯(PQ,paraquat)是一種劇毒除草劑,廣泛應用于世界各地,注射PQ入體可以引起多種臟器尤其是肺臟的損傷,研究認為PQ誘導的肺損傷包括急性期和慢性期改變,其急性期主要表現為上皮細胞損傷、肺水腫和炎癥;而慢性進行性肺纖維化是非常嚴重的慢性肺損傷,死亡率高達25%-70%,通常在注射PQ數天至數周后發(fā)病[12]。然而,肺纖維化分子機制并不明確。白介素-6(IL-6,Interleukin 6)是一種多功能性細胞因子,通過不同信號通路參與多種自體免疫性疾病和慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。IL-6細胞來源廣泛,主要來源是巨噬細胞和單核細胞[14,15]。巨噬細胞是免疫應答的關鍵性組成部分之一,也是疾病過程中炎癥反應的主導調節(jié)因素,巨噬細胞釋放的IL-6進入細胞間隙后可通過旁分泌的方式影響纖維化進程和炎癥反應。IL-6通過IL-6受體和gp130來發(fā)揮其生物學活性,IL-6與IL-6膜結合型受體結合后激活gp130二聚體,三者共同組成具有高親和力的功能型復合物。功能型復合物激活JAKs(Janus kinases)從而激動gp130酪氨酸759來源的SHP-2/ERKMAPK信號通路和gp130 YXXQ介導的JAK/STAT信號通路[16],使IL-6具備同時發(fā)揮兩種不同甚至相對立功能的能力,而IL-6最終的功能趨向可能是多種信號通路共同作用的結果[17]。IL-6能夠促進膠原纖維沉積于多種器官,例如腎臟、心臟以及皮膚等[18],研究報道IL-6在發(fā)生肺纖維化的人以及小鼠體內高表達[17,19-23],但是,IL-6在纖維化中的作用以及調節(jié)機制仍亟待探究。表觀遺傳學是研究基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下基因表達可遺傳變化的一門分支學科。組蛋白修飾(組蛋白乙�；�、甲基化、磷酸化、脫氨基化、β-N-乙酰葡糖胺、ADP核糖基化、泛素化和蘇素化等)作為其研究對象之一,通過影響組蛋白與DNA的親和性來改變染色質的結構狀態(tài)調節(jié)基因表達。組蛋白乙酰化是最常見的組蛋白修飾,主要通過組蛋白乙�；�(HAT)和組蛋白去乙�；�(HDAC)達到修飾目的。研究報道組蛋白乙�；谘装Y反應、纖維化和PQ所致帕金森模型中發(fā)揮作用,由此,我們猜想組蛋白乙酰化在PQ所致肺纖維化和急性炎癥中是否具有調控作用以及如何發(fā)揮調控作用?CRISPR-ON是一種RNA介導的轉錄激活系統,是新型、高效誘導特定基因表達的基因編輯系統[24,25]。CRISPR-ON由三部分組成:Cas9-VP64,sgRNA和MS2-P65-HSF1,三者共同形成蛋白復合物-協同激活介質(SAM),能高效激活同一細胞單個或多達10個內源基因的轉錄[26]。本課題以CRISPR-ON為探索調劑機制的一種重要手段,探究PQ肺纖維化中可能的調控機制。因此,本研究的主要目的是明確IL-6在PQ誘導的肺纖維化中的作用,同時探究表觀遺傳在IL-6轉錄調控的作用。第一部分:IL-6在PQ肺纖維化中的作用研究方法:1.構建并驗證PQ中毒的動物模型。2.通過檢測mRNA及蛋白表達的方法從PQ動物模型中篩選出表達異常的基因。3.通過對細胞系的篩選確定升高表達的IL-6的來源。4.阻斷IL-6信號通路以明確IL-6在PQ肺纖維化中的作用。5.通過巨噬細胞與上皮細胞共培養(yǎng)實驗探究IL-6在肺纖維化中的作用機制。結果:1.C57BL/6小鼠腹腔注射PQ10mg/kg 48h和1month構建PQ中毒的急、慢性動物模型,使用HE染色和MASSON染色驗證了模型構建成功。2.提取動物模型肺組織RNA并采用qPCR篩選了 IL-6、IL-1β、IL-8、COX-2、MMP9、TnF-α和VCAM1等炎癥及其相關細胞因子,發(fā)現IL-6在動物模型中呈PQ劑量依賴性增高,同時蛋白檢測結果和mRNA的結果一致。3.使用PQ處理HLF、16HBE和BMDM發(fā)現IL-6只在BMDM中呈時間依賴性和劑量依賴的升高。4.小鼠腹腔注射IL-6受體抑制劑Gp130Fc和PQ后檢測小鼠肺纖維化的程度,發(fā)現纖維化相關基因在單獨注射PQ的小鼠肺臟中表達高于對照組,而在給予Gp130Fc的小鼠肺臟中表達降低。同時,MASSON染色也證實了 Gp130Fc可以減輕肺纖維。另外,在3T3細胞中給予重組IL-6后纖維化相關基因變化無明顯變化,排除了 IL-6直接影響纖維細胞的作用方式。5.通過共培養(yǎng)實驗方法發(fā)現上皮細胞中EMT相關基因在給予PQ處理的BMDM裂解液后高表達,而同時給予Gp130Fc后表達降低。由此證明了BMDM分泌的IL-6通過促進EMT在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。結論:我們成功構建PQ肺損傷的急性肺炎癥模型和慢性肺纖維化的模型,在動物模型中篩選多種細胞因子,并通過一系列的研究手段確定并驗證了 IL-6在肺纖維化中的重要作用。此外,在對PQ肺纖維化中IL-6高表達的深入研究發(fā)現,IL-6通過EMT促進PQ肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。第二部分:IL-6在PQ肺纖維化中調節(jié)機制的研究方法:1.在體內、體外實驗中給予HDAC抑制劑和HAT抑制劑后,檢測IL-6的mRNA和蛋白表達以探究組蛋白乙酰化對于IL-6表達的影響。2.在體內、體外實驗中給予HDAC抑制劑和HAT抑制劑后,檢測組蛋白乙酰化對PQ所致肺損傷的影響。3.通過檢測HDAC各亞型的表達進一步明確HDACs在PQ所致肺纖維化中的重要作用。4.通過雙熒光素酶報告基因檢測、CRISPR-ON和ChIP實驗探究IL-6的表觀遺傳調控機制。結果:1.通過qPCR和ELISA實驗發(fā)現IL-6受組蛋白乙�；{控。2.通過HE染色、MASSON染色、免疫熒光、qPCR和Western Blot實驗發(fā)現組蛋白乙酰化對PQ肺損傷和EMT相關基因表達具有調節(jié)作用。3.經qPCR檢測,HDAC3在PQ處理的肺組織和BMDM中的呈劑量依賴性和時間依賴性降低。4.雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示VPA增強IL-6啟動子區(qū)活性,CRISPR-ON技術證實VPA、Anacardic acid分別促進和抑制IL-6的轉錄,另外,ChIP-qPCR技術也驗證了巨噬細胞中IL-6啟動子區(qū)的表觀遺傳改變。結論:實驗結果顯示IL-6在PQ處理的肺組織和BMDM中的表達受組蛋白乙�；恼{控,同時HAT抑制劑能夠減輕PQ肺纖維化。隨后,我們在體內、體外檢測HDAC各亞型的表達發(fā)現HDAC3呈PQ劑量依賴性和時間依賴性的降低,此結果和IL-6的表達趨勢恰好相反,于是我們推測IL-6的表達可能主要由HDAC3調控。最后,雙熒光素酶報告基因檢測、CRISPR-ON以及ChIP的實驗結果表明IL-6啟動子區(qū)受到組蛋白乙酰化的調控。小結研究報道高表達的IL-6在纖維化疾病中具有作用,但IL-6在其中的作用機制及調控機制尚不明確。本研究的首要目的是明確IL-6在PQ介導的肺纖維化中的作用并探究表觀遺傳是否參與IL-6的轉錄調控。我們構建了 PQ中毒的動物模型和細胞模型,發(fā)現IL-6的mRNA和蛋白表達在處理組小鼠的肺臟及細胞中呈時間依賴性和劑量依賴性增高。同時,研究結果表明IL-6是通過增強EMT促進PQ肺纖維化發(fā)生發(fā)展的。另外,IL-6在肺纖維化中的表達和功能受表觀遺傳調控,首先,HDAC抑制劑促進IL-6在肺纖維化中的表達,HAT抑制劑抑制IL-6表達;其次,CRISPR-ON促進IL-6轉錄的作用受到HDAC抑制劑的增強和HAT抑制劑的減弱;最后,我們通過ChIP實驗發(fā)現HDAC抑制劑增強IL-6啟動子區(qū)組蛋白激活標記物H3K4me3和H3K9ac表達。綜上,IL-6通過EMT在PQ誘導的肺纖維化中發(fā)揮作用并且在體內、外都受到組蛋白乙�；{控。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R563

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本文編號：1289833