本文關鍵詞：中藥復方牛貝消核提取物對結核分枝桿菌作用機制的研究

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【摘要】：目的:評價牛貝消核驗方治療結核病的臨床療效;了解結核分枝桿菌標準株H37Rv在Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基中的生長規(guī)律和牛貝消核提取物對結核分枝桿菌標準株H37Rv增殖的影響;研究牛貝消核提取物對結核分枝桿菌標準株H37Rv蛋白質組的影響,確定牛貝消核作用的關鍵蛋白,闡明牛貝消核提取物抗結核的作用機制,為發(fā)現(xiàn)新的抗結核藥物靶標和新藥研發(fā)提供實驗基礎。方法:1.牛貝消核驗方治療結核病的臨床療效評價。對1998年～2012年就診于四川省內(nèi)江仁愛醫(yī)院傳染科和內(nèi)江陳氏診所的90例結核病患者的臨床資料進行回顧性研究。2.牛貝消核提取物對結核分枝桿菌標準株H37Rv增殖的影響。在接種有結核分枝桿菌標準株H37Rv的Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基中加入蒸餾水為陰性對照組,加入異煙肼為陽性對照組,加入牛貝消核提取物為實驗組,每隔7天取100μL培養(yǎng)物,10倍梯度稀釋,涂板,培養(yǎng)3-4周菌落計數(shù)(CFU),繪制細菌生長曲線。3.牛貝消核提取物對結核分枝桿菌標準株H37Rv蛋白質組的影響。在培養(yǎng)至對數(shù)期的結核菌Middle brook7H9液體培養(yǎng)物中,加入蒸餾水為陰性對照組,加入異煙肼為陽性對照組,加入牛貝消核提取物為實驗組,分別于加入藥物前以及加入藥物后6h和7d取出培養(yǎng)物,應用雙向電泳和質譜技術比較分析牛貝消核提取物作用前后結核分枝桿菌標準株H37Rv蛋白表達譜的差異。結果:1.牛貝消核驗方治療結核病的臨床療效評價:治療1～2個療程后,湯劑組83例患者中治愈46例(55.42%),顯效29例(34.94%),有效6例(7.23%),無效2例(2.41%),總有效率97.59%;散劑組7例患者中,治愈5例(71.43%),顯效2例(28.57%),總有效率I00%。2.牛貝消核提取物對結核分枝桿菌標準株H37Rv增殖的影響:培養(yǎng)28天后陰性對照組菌落數(shù)增多[(CFUs/ml)Log=5.93±0.11],INH組菌落數(shù)為0,牛貝消核提取物組菌落數(shù)減少[(CFUs/ml)Log10=4.31±1.09],各組間有顯著性差異(P=0.0118,0.01P0.05)。3.牛貝消核提取物對結核分枝桿菌標準株H37Rv蛋白質組的影響:與陰性對照組相比,牛貝消核提取物組有142個差異蛋白斑點,INH組有147個差異蛋白斑點,合計149個;選取其中的71個斑點進行質譜鑒定,得到41個高可信度蛋白,其中INH組有35個(7個上調(diào),28個下調(diào)),牛貝消核提取物組有39個(5個上調(diào),34個下調(diào)),兩組共同差異蛋白為33個。分析其生物學功能,可知:參與免疫反應的有免疫蛋白MPT64(immunogenicproteinMPT64)、角質酶培養(yǎng)濾液蛋白21(CFP21)、富于丙氨酸和脯氨酸的分泌蛋白 Apa(alanine and proline-rich secreted protein Apa);參與蛋白合成的有 50S 核糖體蛋白 L7/L12(50S ribosomal protein L7/L12)、30S 核糖體蛋白 S1(30S ribosomal protein S1)、觸發(fā)因子(trigger factor)、分子伴侶 GroEL(molecular chaperone GroEL)、熱休克蛋白X(heat shock protein hspX);參與能量代謝的蛋白有:磷酸甘油酸變位酶(phosphoglyceromutase)、磷酸丙糖異構酶(triosephosphate isomerase)、磷酸丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase)、轉醇醛酶(transaldolase)、腺苷酸激酶(adenylate kinase)、磷酸轉移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system,PTS)葡萄糖轉運蛋白 IIA(glucose transporter subunit IIA)和糖原累積調(diào)節(jié)蛋白 GarA(glycogen accumulation regulator GarA);參與抗氧化應激的蛋白有:2-半胱氨酸過氧化物還原酶(2-Cys peroxiredoxin)、硫氧還蛋白(thioredoxin)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)和DNA饑餓/固定相保護蛋白(DNA starvation/stationary phase protection protein,Dsp);參與氨基酸合成的蛋白有:磷酸甘油酸脫氫酶(phosphoglycerate dehydrogenase)、γ-谷氨酰磷酸還原酶(gamma-glutamyl phosphate reductase)和 4-輕基-tetrahydrodipicolinate 還原酶(4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase);與細菌的應激力有關的蛋白有:熱休克蛋白X(heatshockproteinhspX)和普遍應激蛋白家族(Universal stress protein family)。其中抗氧化應激、糖酵解和熱休克蛋白等與結核分枝桿菌的潛伏感染有關。結論:1.牛貝消核復方湯劑和散劑治療結核病療效顯著。2.1mg/ml的牛貝消核提取物能抑制結核分枝桿菌標準株H37Rv的生長。3.牛貝消核提取物可通過抑制結核分枝桿菌的蛋白合成、能量代謝、抗氧化應激,減弱結核分枝桿菌在巨噬細胞中的生存能力,影響其潛伏感染,從而發(fā)揮抗結核作用。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R259

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本文編號：1289481