發(fā)布時(shí)間：2017-12-14 15:04

  本文關(guān)鍵詞：乳酸桿菌表面活性片段通過(guò)表觀遺傳學(xué)調(diào)控腸上皮炎性細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制研究

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【摘要】：目的觀察MIMP對(duì)炎癥性腸病小鼠的腸道炎癥及腸道微生態(tài)的影響;探究MIMP對(duì)炎性細(xì)胞因子的作用效果和調(diào)節(jié)方式,并探討相關(guān)作用機(jī)制。方法(1)將小鼠分為3組:DSS+MIMP組,DSS組和健康對(duì)照組。干預(yù)期間,觀察小鼠體重變化情況,腹瀉、血便、死亡等發(fā)生率,觀察各組小鼠腸道整體情況并制作HE染色切片,觀察腸上皮組織病理學(xué)的改變;利用右旋糖苷異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-Dextran)灌胃,檢測(cè)小鼠活體腸道通透性,并利用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR,q RT-PCR)檢測(cè)各組小鼠腸道上皮中緊密連接蛋白(JAM-1,Occludin,ZO-1)的表達(dá)水平;利用q RT-PCR檢測(cè)各組小鼠腸道上皮中炎性細(xì)胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10)的表達(dá),利用16Sr RNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)各組小鼠腸道微生態(tài)的變化情況。(2)利用類(lèi)小腸上皮細(xì)胞的Caco-2細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞(PBMCs)在Tranwells條件下建立共培養(yǎng)模型,利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為炎癥刺激,利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)MIMP在不同濃度及不同孵育時(shí)間下對(duì)腸道微環(huán)境中炎性細(xì)胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10)的調(diào)節(jié)情況。利用ELISA和q RT-PCR檢測(cè)TLR4抑制劑對(duì)LPS介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子分泌水平的影響,并與MIMP的作用效果相互比較。利用Western blot檢測(cè)MIMP和TLR4抑制劑對(duì)MAPK及NF-κB通路的調(diào)節(jié)情況,并利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)MIMP在不同濃度及不同孵育時(shí)間下對(duì)NF-κB活性影響的變化趨勢(shì)。(3)利用Western blot檢測(cè)MIMP及TLR4抑制劑對(duì)由LPS介導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞整體水平的組蛋白(H3,H4)乙�；恼{(diào)節(jié)情況,利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Ch IP)技術(shù)檢測(cè)MIMP在不同濃度及不同孵育時(shí)間下對(duì)具體水平的IL-17及IFN-γ上游啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白(H3,H4)乙�；恼{(diào)節(jié)情況;利用q RT-PCR檢測(cè)MIMP對(duì)LPS介導(dǎo)的組蛋白去乙�；�(histone deaceylase,HDAC)表達(dá)水平的調(diào)節(jié)情況。結(jié)果(1)與DSS組小鼠相比,MIMP+DSS組整體情況較好,體重減輕程度輕,腹瀉、便血及死亡發(fā)生率低,疾病活動(dòng)指數(shù)顯著下降;MIMP不但可以改善腸道整體情況,提高腸道長(zhǎng)度(p0.05),還可有效提升組織學(xué)評(píng)分(p0.001);MIMP+DSS組血漿中FITC-Dextran的含量顯著低于DSS組(p0.01),而腸上皮中緊密連接蛋白(JAM-1,Occludin,ZO-1)的表達(dá)水平則顯著高于DSS組(p0.01)。此外,MIMP可降低腸道上皮中促炎性細(xì)胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23)的水平,并升高抑炎性細(xì)胞因子(IL-4,IL-10)的水平。16Sr RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)MIMP+DSS組較DSS腸道微生態(tài)多樣性顯著提升,shannon指數(shù)顯著降低(p0.05),simpson指數(shù)存在一定上升趨勢(shì)(p=0.055);主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCo A)提示三組小鼠腸道微生態(tài)在各分類(lèi)學(xué)水平上存在明顯差異;樣本聚類(lèi)樹(shù)與柱狀圖組合分析(The sample clustering tree and histogram analysis)提示MIMP+DSS組與健康對(duì)照組腸道微生態(tài)的相似程度更高;線性判別分析(LEf Se)分析顯示厚壁菌屬(Firmicute)是DSS組小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬,明串珠菌屬(Leuconostocaceae)是DSS+MIMP組的優(yōu)勢(shì)菌屬,擬桿菌屬(Bacteroides)是健康對(duì)照組腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬。(2)在共培養(yǎng)模型中,MIMP可扭轉(zhuǎn)因LPS引起的炎性細(xì)胞因子的分泌,降低促炎性細(xì)胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23)的水平,升高抑炎性細(xì)胞因子(IL-4,IL-10)的水平;且MIMP的調(diào)節(jié)存在一定的劑量與時(shí)間依賴(lài)性,在特定濃度和時(shí)間時(shí)(1ng/ml,12h),MIMP的作用效應(yīng)最為顯著;同時(shí)抑制性實(shí)驗(yàn)證實(shí)MIMP與TLR4抑制劑具有相同的調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的能力;此外,MIMP和TLR4抑制劑均可有效阻斷MAPK及NF-κB通路激活,且隨著MIMP劑量的提高和時(shí)間的延長(zhǎng),NF-κB的活性也呈現(xiàn)階梯狀下降趨勢(shì)。(3)LPS可使得組蛋白(H3,H4)整體水平的乙�；潭忍岣�,而MIMP與TLR4抑制劑干預(yù)可有效降低其乙�；潭�,并存在劑量依賴(lài)性;在具體水平中,隨著劑量的提高和時(shí)間的延長(zhǎng),MIMP可有效降低IL-17和IFN-γ上游啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白(H3,H4)的乙酰化程度;同時(shí),MIMP還可以顯著上調(diào)部分HDAC的表達(dá)。結(jié)論MIMP可有效改善IBD小鼠的炎癥狀態(tài)及腸屏障功能,顯著下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá),上調(diào)抑炎性細(xì)胞因子的表達(dá),并糾正IBD小鼠的腸道微生態(tài)紊亂;MIMP可通過(guò)一定劑量和時(shí)間依賴(lài)的方式調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的分泌,并可有效阻斷MAPK及NF-κB信號(hào)通路的激活;MIMP可有效降低整體及具體水平的組蛋白乙�；潭�,提高HDAC的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)了MIMP改善腸道炎癥的現(xiàn)象并闡明其相關(guān)機(jī)制,擴(kuò)展了人們對(duì)于炎癥治療的認(rèn)識(shí),具有一定的理論創(chuàng)新。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R574

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

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本文編號(hào)：1288323