本文關(guān)鍵詞：cAMP直接激活蛋白Epac-1在病毒感染中的功能與機(jī)制研究

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【摘要】：截止2014年底,全世界約有三千六百九十萬(wàn)名患者感染艾滋病病毒。作為一個(gè)僅9.2kb的RNA病毒,HIV逆轉(zhuǎn)錄酶病毒通過(guò)編碼數(shù)個(gè)蛋白,成功地躲避了機(jī)體免疫系統(tǒng)的檢測(cè),并最終摧毀人體免疫防御機(jī)制。HIV的強(qiáng)大之處在于利用宿主細(xì)胞自身的免疫系統(tǒng),去促進(jìn)病毒的復(fù)制與感染。而GPCRs及其經(jīng)典下游信號(hào)通路,在AIDS的病程發(fā)展中,起到了顯著的作用。不僅僅是HIV,已有文獻(xiàn)報(bào)道皰疹病毒(epstein-barrvirus,EBv)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)、粘液瘤病毒(Myxomavirus)等病毒均能夠"挾持" GPCRs及其經(jīng)典下游信號(hào)通路來(lái)調(diào)控細(xì)胞因子、趨化因子的釋放,從而起到降低宿主免疫力,促進(jìn)病毒感染的作用。本課題探究了 GPCRs下游經(jīng)典的cAMP/Epac信號(hào)通路在病毒感染中的功能,以探討GPCRs經(jīng)典信號(hào)通路在病毒感染中作用的具體機(jī)制,為闡明GPCRs臨床抗病毒功能提供基礎(chǔ)研究與理論支持。論文首先運(yùn)用Elisa法檢測(cè)病毒感染時(shí)細(xì)胞中第二信使分子cAMP的變化。進(jìn)而利用人源宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞系作為研究對(duì)象,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)cAMP下游信號(hào)通路抑制劑ESI09和H89對(duì)細(xì)胞增殖的影響;在此基礎(chǔ)之上應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)ESI09和H89處理后細(xì)胞中GPCR通路下游效應(yīng)蛋白Epac-1的表達(dá)變化;同時(shí)在VSV病毒感染抑制劑處理的細(xì)胞后,檢測(cè)VSV病毒在胞內(nèi)的復(fù)制變化;采用WesternBlot法對(duì)病毒蛋白VSVG和cAMP信號(hào)通路下游效應(yīng)蛋白Epac-1的含量變化加以驗(yàn)證性分析;為進(jìn)一步探究Epac-1調(diào)控病毒感染的分子機(jī)制,我們還檢測(cè)了 Epac-1蛋白敲除后細(xì)胞因子的表達(dá)變化。結(jié)果表明,病毒感染可誘導(dǎo)胞內(nèi)第二信使cAMP濃度上升,進(jìn)而上調(diào)Epac-1蛋白表達(dá)。同樣高濃度的cAMP在病毒感染過(guò)程中起到了促進(jìn)作用。針對(duì)cAMP下游效應(yīng)蛋白Epac-1的敲除/抑制,在病毒感染中起到了明顯的免疫保護(hù)作用。此外我們通過(guò)RT-PCR技術(shù)在Epac-1敲除細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn),Epac-1敲除可以顯著提高機(jī)體內(nèi)白介素29(IL-29)即Ⅲ型干擾素(IFN-λ)的表達(dá)。而當(dāng)利用抑制劑Suplatast Tosylate抑制了白介素29的功能后,cAMP下游效應(yīng)蛋白Epac-1的敲除/抑制對(duì)于細(xì)胞的抗病毒作用即被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果初步表明cAMP/EPAC1信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子-白介素29的釋放,發(fā)揮免疫調(diào)控作用。cAMP/Epac信號(hào)通路的阻斷在HeLa細(xì)胞中能引起白介素29的表達(dá)升高,白介素29可能通過(guò)激活干擾素刺激基因(ISGs)的表達(dá)來(lái)上調(diào)抗病毒蛋白Mx等多種免疫活性因子的表達(dá),這是機(jī)體抗病毒作用的重要效應(yīng)途徑。綜上所述,針對(duì)cAMP下游效應(yīng)蛋白Epac-1的敲除/抑制可能通過(guò)激活或上調(diào)IL-29的表達(dá),來(lái)發(fā)揮抗病毒及免疫調(diào)節(jié)的作用。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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