本文關(guān)鍵詞：燈心草菲類成分代謝特征及其對藥物代謝酶活性影響研究

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【摘要】：研究背景和目的:燈心草是燈心草科燈心草屬植物燈心草(Juncus effsus L.)的干燥莖髓,具有清熱通淋、清心除煩的功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),燈心草中的菲類成分是其抗焦慮的活性成分,且菲類成分以厄弗酚和去氫厄弗酚的含量居多。由于菲類成分的體內(nèi)外代謝情況尚不明確,為全面闡釋菲類成分的代謝特征,本研究在課題組前期對去氫厄弗酚在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和代謝過程研究的基礎(chǔ)上,研究菲類成分去氫厄弗酚和厄弗酚的代謝特征及其與肝藥酶的相互作用,為菲類成分的新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法:1采用HPLC-ESI-MS2分析小鼠灌胃給予菲類成分厄弗酚后的血液、尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物,推測厄弗酚在小鼠體內(nèi)可能的代謝途徑。2采用鈣沉淀法制備小鼠肝微粒體,考馬斯亮藍法測定其蛋白含量;建立去氫厄弗酚和厄弗酚在小鼠肝微粒體中的HPLC檢測方法;以孵育時間,小鼠肝微粒體蛋白濃度和底物濃度為考察因素,優(yōu)化孵育條件,確定最佳孵育體系;同時,結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS2鑒定去氫厄弗酚和厄弗酚在小鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物。3采用專屬性抑制劑法,分別以α-萘黃酮、噻氯吡啶、槲皮素、磺胺苯吡唑、奎尼丁、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、酮康唑為CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D2、CYP2E1、CYP3A4的抑制劑,通過加入系列濃度專屬性抑制劑共溫孵,加等量甲醇作為陰性對照。鑒別參與去氫厄弗酚和厄弗酚代謝的CYP450亞酶。4采用"Cocktail"探針底物法研究去氫厄弗酚和厄弗酚對小鼠肝微粒體CYP450亞酶的體內(nèi)外活性影響,選擇非那西丁、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、氯唑沙宗、睪酮分別作為CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP3A4的探針底物,分別加入去氫厄弗酚和厄弗酚與探針底物共溫孵,考察二者對小鼠肝微粒體CYP540亞酶體外活性影響;將小鼠分為5組,每組5只,分別長期灌胃去氫厄弗酚(5、20mg·kg-1)厄弗酚(5、20mg·kg-1)和等量羧甲基纖維素鈉,連續(xù)灌胃7天后,斷頸處死,制備肝微粒體,采用上述"Cocktail"探針底物法,考察去氫厄弗酚和厄弗酚長期給藥后對小鼠體內(nèi)CYP450亞酶活性的影響。5將小鼠分為5組,每組5只,分別長期灌胃去氫厄弗酚(5、20mg·kg-1)厄弗酚(5、20mg·kg-1)和等量羧甲基纖維素鈉,連續(xù)灌胃7天后,斷頸處死,制備肝胞漿液。以4-硝基苯酚作為SULT1A1反應(yīng)底物,采用紫外分光光度法測定SULT 1A1的活性�？疾烊涠蚋シ雍投蚋シ訉ULT 1A1活性的影響。結(jié)果:1在小鼠血漿、尿液和糞便中共檢測出12個代謝產(chǎn)物,多數(shù)以硫酸結(jié)合、葡萄糖醛酸結(jié)合方式存在,少量以同分異構(gòu)體存在。2所建立HPLC測定方法精密度,準(zhǔn)確度,基質(zhì)效應(yīng)等均符合生物樣品測定要求,在24h內(nèi)穩(wěn)定性符合實驗要求;最佳孵育體系為:去氫厄弗酚濃度20 μg· mL-1或厄弗酚10 μg · mL-1在包含小鼠肝微粒體蛋白濃度1 mg · mL-1的體系中,37 ℃恒溫振蕩溫孵60 min;去氫厄弗酚在肝微粒體中檢測到3個代謝產(chǎn)物,厄弗酚在肝微粒體中檢測到1個代謝產(chǎn)物,包括了氧化產(chǎn)物,羥基化產(chǎn)物和同分異構(gòu)體。3參與去氫厄弗酚代謝的CYP450酶亞型主要是CYP2C8,CYP1A2和CYP2D2;參與厄弗酚代謝的CYP亞酶主要是CYP2C8和CYP2B6。4體外實驗結(jié)果表明,去氫厄弗酚對CYP2C9的IC50為0.096 μmol · L-1,對CYP2E1 的 IC50 為 115.4 μmol · L-1,對 CYP1A2、CYP2C19、CYP3A4 均無抑制作用;厄弗酚對CYP2C9表現(xiàn)出抑制作用。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,去氫厄弗酚高劑量組(20mg·kg-1)對小鼠體內(nèi)CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4的活性有抑制的作用;厄弗酚高劑量組(20mg·kg-1)對小鼠體內(nèi)CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1的活性有抑制的作用。5長期給藥后,去氫厄弗酚給藥組(5、20mg·kg-1)均對小鼠體內(nèi)的SULT1A1活性無明顯影響;厄弗酚給藥組(5、20mg·kg-1)均對小鼠體內(nèi)的SULT 1A1活性有顯著的誘導(dǎo)作用。結(jié)論:實驗結(jié)果表明,去氫厄弗酚和厄弗酚在肝微粒體中分別檢測出3個和1個代謝產(chǎn)物,結(jié)合實驗室前期對去氫厄弗酚體內(nèi)代謝研究結(jié)果,表明燈心草菲類成分去氫厄弗酚和厄弗酚在體內(nèi)主要發(fā)生以硫酸結(jié)合反應(yīng)為主的Ⅱ相代謝反應(yīng),且7位羥基可能是其硫酸結(jié)合的主要活性位點;酶亞型鑒定結(jié)果顯示,在小鼠肝微粒體中,去氫厄弗酚和厄弗酚均是多個CYP450酶亞型參與代謝的化合物,整體上看CYP2C8是去氫厄弗酚和厄弗酚代謝時承擔(dān)主要代謝作用的CYP450酶亞型;結(jié)合體內(nèi)外抑制實驗結(jié)果,去氫厄弗酚對小鼠CYP2E1活性具有抑制作用,厄弗酚對小鼠CYP2C9活性具有抑制作用,同時厄弗酚能誘導(dǎo)小鼠SULT1A1活性。以上研究結(jié)果將為全面評價去氫厄弗酚和厄弗酚的代謝特征提供科學(xué)參考,并為歸納燈心草菲類成分類化合物基于藥物代謝酶的代謝特征提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：1273814