發(fā)布時間：2017-12-08 16:38

  本文關(guān)鍵詞：自噬與EMT在亞砷酸鈉所致肝細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及分子機制

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【摘要】：砷化物是一種廣泛存在于環(huán)境中的人類確定致癌物,其存在形式主要有兩種,分別是砷酸鹽和亞砷酸鹽,其中最主要的存在形式為亞砷酸鈉(NaAs02)。有報道顯示,長期暴露于砷化物會導(dǎo)致多種疾病,在砷污染地區(qū)肝癌的發(fā)病率顯著增高,威脅當(dāng)?shù)鼐用竦纳】怠Ｉ榛镏掳C制有眾多假說,目前諸多研究顯示,自噬和EMT與NaAs02所致人肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其具體作用過程和分子機制還有待進一步探討。自噬是一種重要分解代謝機制,在真核細胞中可以起到維持細胞穩(wěn)態(tài)的作用。自噬功能紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)參與了多種病理生理過程,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要的作用。長期暴露于砷化物會導(dǎo)致細胞自噬水平出現(xiàn)紊亂,無法正常分解代謝有害組分,導(dǎo)致細胞內(nèi)EMT轉(zhuǎn)錄因子累積,促進EMT過程的發(fā)生,進而引起細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。有研究報道m(xù)iRNAs通過調(diào)控下游信號通路參與了 NaAs02引起的自噬過程。miR-21是最早發(fā)現(xiàn)的致癌miRNAs之一,在本課題組前期研究中,在NaAs02處理多種細胞中均高表達,其中包括人正常肝細胞(L-02)。而miR-21參與NaAsO_2所致自噬的分子機制和自噬及EMT在肝細胞惡性轉(zhuǎn)化中的調(diào)控作用尚未報道。目的運用多種分子生物學(xué)方法探討NaAs02處理對miR-21的影響及miR-21對自噬的調(diào)控作用,并進一步研究自噬和EMT在NaAsO_2所致肝細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及其部分分子機制,從而為進一步研究砷化物致癌機制的分子機制和發(fā)現(xiàn)砷化物致肝癌的分子標(biāo)志提供科學(xué)線索。方法一、亞砷酸鈉急性處理對L-02細胞自噬水平的影響用 0.0、1.0、2.0、4.0 或 8.0 μM NaAsO_2 分別處理 L-02 細胞 24 h,或分別用0.0或2.0μM NaAsO_2分別急性處理肝L-02細胞0、3、6、12或24h后,或分別用 2.0μM NaAsO_2 或 100 nM 的 Rapamycin 處理 L-02 細胞 24 h 后,Western blot檢測細胞mTOR、beclin 1和LC3 II/I蛋白水平,免疫熒光實驗檢測細胞LC3表達水平,用透射電鏡檢測細胞自噬體數(shù)目。以觀察NaAs02對L-02細胞自噬水平的影響。二、ERK通路在亞砷酸鈉所致L-02細胞自噬激活中的作用用0.0、1.0、2.0、4.0或8.0 μM NaAsO_2分別處理L-02細胞24 h,或分別用0.0或2.0 μM NaAsO_2分別急性處理肝L-02細胞0、3、6、12或24 h后,或用10μM MEK/ERK 抑制劑 U0126 處理 L-02 細胞 3 h 后,再用 0.0 或 2.0μM NaAs02處理 L-02 細胞 24 h,Western blot 檢測細胞 p-ERK、ERK、PTEN、mTOR、beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ水平。以觀察ERK通路在NaAso2所致L-02自噬激活中的作用。三、亞砷酸鈉對L-02細胞miR-21水平和其靶蛋白的影響分別用0.0、1.0、2.0、4.0或8.0μMNaAsO_2分別處理L-02細胞24h,或分別用0.0或2.0 μM NaAsO_2分別急性處理L-02細胞0、3、6、12或24 h后,qRT-PCR檢測細胞miR-21水平,Western blot檢測細胞PTEN、PDCD4和Spry 1蛋白水平。以觀察NaAs02對于L-02細胞miR-21水平和其靶蛋白表達水平的影響。四、miR-21在亞砷酸鈉所致L-02細胞自噬激活中的作用分別用100 nM anti-miR-21和anti-miR-nc轉(zhuǎn)染L-02細胞,然后分別暴露于0.0 或 2.0μM NaAs02 同樣處理 24 h,qRT-PCR 檢測細胞 miR-21 水平,Western blot檢測細胞PTEN、ERK、beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和mTOR水平。以觀察下調(diào)miR-21對PTEN、ERK及自噬相關(guān)蛋白水平的影響。五、上調(diào)PTEN對亞砷酸鈉急性處理L-02細胞ERK及自噬相關(guān)蛋白的影響用pCDNA-PTEN和pCDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L-02細胞24 h,然后用暴露于0.0或2.0μMNaAsO_2 同樣處理 24 h,Western blot 檢測細胞 PTEN、p-ERK、mTOR、beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ。以觀察PTEN對亞砷酸鈉急性處理L-02細胞ERK及自噬相關(guān)蛋白的影響。六、miR-21通過PTEN參與亞砷酸鈉所致L-02細胞ERK激活和自噬激活分別用 100 nM anti-miR-21 或 anti-miR-nc 和 25 nM PTEN siRNA 或 Con siRNA 共轉(zhuǎn)染 L-02 細胞 24 h,然后再用 2.0μM NaAsO_2 處理 24 h,Western blot檢測細胞PTEN、P-ERK、ERK、mTOR、beclin1、LC3蛋白水平,用透射電鏡檢測L-02細胞自噬體的數(shù)量。以觀察miR-21通過PTEN參與亞砷酸鈉所致L-02細胞ERK激活和自噬激活的作用。七、亞砷酸鈉慢性處理對L-02細胞自噬流的影響用0.0或2.0 μM NaAsO_2分別誘導(dǎo)L-02細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,慢性處理L-02細胞至30代后(約15 w),得到對照L-02細胞(L-02)和砷惡轉(zhuǎn)的L-02細胞(T-L-02)。Western blot檢測L-02細胞和T-L-02細胞自噬相關(guān)蛋白p62、beclin 1、LC3 II/I和ATG5蛋白水平,用mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒檢測自噬流水平。用100 nM的Rapamycin處理L-02細胞24 h作為陽參,然后和對照細胞及T-L-02細胞同樣處理后用透射電鏡觀察自噬體的情況。以觀察慢性處理對于L-02細胞自噬流的影響。八、亞砷酸鈉慢性處理對L-02細胞EMT的影響用0.0或2.0μM NaAsO_2分別誘導(dǎo)L-02細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,慢性處理L-02細胞至30代后(約15 w),得到0、10、20和30代對照L-02細胞和砷惡轉(zhuǎn)的T-L-02細胞。在顯微鏡下觀察細胞形態(tài),用Western blot實驗和免疫熒光實驗檢測EMT表達水平。以觀察NaAsO_2對L-02細胞EMT的影響。九、調(diào)節(jié)自噬流對亞砷酸鈉處理L-02細胞EMT的影響用 25 nM 的 ATG5 siRNA 或者 Con siRNA,或用 100 nM 的 Rapamycin 處理T-L-02細胞24 h,Western blot實驗檢測自噬相關(guān)蛋白和EMT水平,Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白和EMT指標(biāo)蛋白的表達水平。以觀察自噬流對NaAsO_2處理L-02細胞EMT的影響。十、p62通過Snail參與亞砷酸鈉所致L-02細胞發(fā)生EMT與惡性轉(zhuǎn)化用25 nM的p62 siRNA或Con siRNA處理由2.0 μM NaAsO_2慢性處理30代致惡性轉(zhuǎn)化的T-L-02細胞24 h,Western blot實驗和免疫熒光實驗檢測細胞p62、Snail、E-cadherin和vimentin的蛋白表達水平,用軟瓊脂集落形成實驗檢測細胞惡性程度,用Transwell實驗檢測細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力;分別用0.0或2.0μM的NaAsO_2處理L-02細胞24 h,用Co-IP實驗檢測NaAsO_2處理后L-02細胞p62與Snail的結(jié)合;將L-02細胞和T-L-02細胞同樣進行Co-IP實驗,用Co-IP實驗檢測到p62蛋白與Snail蛋白的結(jié)合能力;用免疫熒光共定位方法觀察T-L-02細胞Snail和p62蛋白的定位表達。以觀察p62控制Snail在NaAs02所致L-02細胞EMT和惡性轉(zhuǎn)化中的作用。結(jié)果一、亞砷酸鈉急性處理對L-02細胞自噬水平的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)用NaAs02急性處理的L-02細胞,隨著NaAsO_2劑量和時間增加,自噬相關(guān)蛋白beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ則逐漸增加;mTOR蛋白水平明顯降低,具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系;2.0 μM NaAsO_2能使得L-02細胞LC3熒光表達增加,自噬體數(shù)目增多。說明NaAsO_2能夠激活L-02細胞發(fā)生自噬。二、ERK通路在亞砷酸鈉所致L-02細胞自噬激活中的作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)用NaAs02急性處理的L-02細胞,隨著NaAsO_2濃度和時間增加,p-ERK蛋白水平隨著劑量和時間增加而升高。2.0μM NaAs02處理L-02細胞相較于對照L-02細胞p-ERK、beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ水平顯著增高,PTEN和mTOR水平降低;而U0126可阻滯2.0μM NaAsO_2處理所致L-02細胞這些蛋白的表達。說明U0126能夠下調(diào)NaAsO_2所致的L-02細胞自噬相關(guān)蛋白升高,提示ERK參與了 NaAsO_2所致的自噬水平上調(diào)。三、亞砷酸鈉對L-02細胞miR-21水平和其靶蛋白的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)用NaAsO_2急性處理的L-02細胞,隨著NaAs02濃度和時間增加,miR-21水平也隨之升高,而miR-21的靶蛋白PTEN、PDCD4和Spry 1蛋白水平均隨著NaAsO_2劑量和時間的增加而減少,并具有一定的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。說明NaAsO_2可以上調(diào)miR-21水平并抑制其靶蛋白的表達。四、miR-21在亞砷酸鈉所致L-02細胞自噬激活中的作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21可阻滯2.0 μM NaAs02處理所致miR-21、beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和p-ERK水平升高及PTEN和mTOR水平降低。說明通過anti-miR-21下調(diào)miR-21可以阻滯NaAs02所致的L-02細胞ERK通路激活和自噬水平的升高,提示miR-21在NaAsO_2所致自噬激活中發(fā)揮重要作用。五、上調(diào)PTEN對亞砷酸鈉急性處理L-02細胞ERK及自噬相關(guān)蛋白的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達PTEN可顯著阻滯2.0 μM NaAsO_2所致L-02細胞PTEN和mTOR降低及beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和p-ERK水平升高。說明高表達PTEN可以抑制NaAs02所致L-02細胞ERK激活,進而激活mTOR通路,抑制自噬相關(guān)蛋白的表達,提示PTEN在NaAsO_2所致L-02細胞自噬中起到了重要調(diào)控作用。六、miR-21通過PTEN參與亞砷酸鈉所致L-02細胞ERK激活和自噬激活結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21可以阻滯亞砷酸鈉引起的PTEN和mTOR降低及ERK和自噬相關(guān)蛋白的beclin、L3Ⅱ/Ⅰ增加,敲除PTEN后則可以逆轉(zhuǎn)這個過程;anti-miR-21處理可以降低自噬體數(shù)目,而聯(lián)合PTEN siRNA后可以逆轉(zhuǎn)這個過程。說明下調(diào)miR-21引起的L-02細胞自噬水平降低可以被關(guān)閉PTEN所阻滯,,提示miR-21的高表達抑制PTEN和激活ERK在NaAsO_2處理L-02細胞自噬激活中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。七、亞砷酸鈉慢性處理對L-02細胞自噬流的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-L-02細胞beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和ATG5表達水平升高,同時自噬底物蛋白p62在T-L-02細胞中也高表達;T-L-02細胞熒光點數(shù)明顯多于L-02細胞,且T-L-02細胞的黃色熒光點和紅色熒光點的比值明顯低于對照細胞;T-L-02細胞的自噬體比例增加,但自噬溶酶體比例減少。說明NaAsO_2處理的T-L-02細胞自噬溶酶體生成受阻,自噬流被阻滯。八、亞砷酸鈉慢性處理對L-02細胞EMT的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.0 μM NaAs02慢性處理30代后所致惡性轉(zhuǎn)化L-02細胞,隨著處理時間延長(細胞惡性程度增加),細胞形態(tài)逐漸由圓形的上皮細胞樣向長梭形間質(zhì)細胞樣轉(zhuǎn)變,E-cadherin的蛋白表達水平逐漸降低,而間質(zhì)細胞指標(biāo)vimentin隨著處理時間的延長而表達顯著增加,EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail也顯著增加。說明NaAs02慢性處理誘導(dǎo)了 L-02細胞發(fā)生EMT。九、調(diào)節(jié)自噬流對亞砷酸鈉處理L-02細胞EMT的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過siRNA關(guān)閉ATG5抑制了 T-L-02細胞beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達,但是增加了 p62的蛋白水平,阻滯了自噬流,進而引起T-L-02細胞Snail和vimentin增加,E-cadherin水平降低;Rapamycin處理引起T-L-02細胞mTOR蛋白的表達降低,進而使得beclin 1和LC3 Ⅱ/Ⅰ水平增高,而p62的表達被抑制,增強了自噬流,進而抑制了 Snail和vimentin的表達,上調(diào)了 E-cadherin的水平。說明自噬流水平在NaAs02所致L-02細胞EMT過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。十、p62通過Snail參與亞砷酸鈉所致L-02細胞發(fā)生EMT與惡性轉(zhuǎn)化結(jié)果發(fā)現(xiàn)p62 siRNA處理關(guān)閉p62引起T-L-02細胞p62、Snail和vimentin蛋白水平和熒光強度降低,E-cadherin蛋白水平和熒光強度增加;p62siRNA處理T-L-02細胞集落形成數(shù)和細胞侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)均顯著低于對照T-L-02細胞。2.0μM NaAsO_2急性處理L-02細胞和慢性處理的T-L-02細胞中均可以觀察到p62和Snail蛋白的結(jié)合。說明p62通過Snail參與了 NaAsO_2所致L-02細胞EMT及惡性轉(zhuǎn)化。結(jié)論1.miR-21通過靶蛋白PTEN調(diào)控ERK在NaAsO_2所致肝細胞自噬中發(fā)揮重要作用。2.NaAs02自噬流阻滯引起肝細胞p62高表達,累積了 Snail進而引起EMT,從而誘導(dǎo)肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 郭華明;郭琦;賈永鋒;劉澤云;姜玉肖;;中國不同區(qū)域高砷地下水化學(xué)特征及形成過程[J];地球科學(xué)與環(huán)境學(xué)報;2013年03期

2 范本yN;王桂林;齊范;李卓;劉懷政;;FGF8b調(diào)控前列腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機制[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年07期

3 金銀龍,梁超軻,何公理,曹靜祥,馬鳳,王漢章,應(yīng)波,吉榮娣,中國地方性砷中毒分布調(diào)查協(xié)作組;中國地方性砷中毒分布調(diào)查(總報告)[J];衛(wèi)生研究;2003年06期

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本文編號：1267108