本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與牙髓細(xì)胞體外共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景:齲病、根尖周病以及牙周病是口腔常見疾病,常常導(dǎo)致牙髓壞死,影響口腔甚至全身健康。利用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段再生牙髓的組織再生工程研究已成為研究重點(diǎn)。研究目的:本研究通過探索共培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)和經(jīng)BMP2誘導(dǎo)后的人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells,DPCs),檢測共培養(yǎng)后對細(xì)胞生物學(xué)性能的影響,并探索兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的最佳比例,為牙髓再生工程研究選擇合適的種子細(xì)胞以及hUCMSCs進(jìn)一步應(yīng)用于牙髓疾病的治療提供理論依據(jù)。材料與方法:(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及鑒定取健康胎兒臍帶,于超凈臺(tái)內(nèi)剝離外膜及血管,將沃頓膠質(zhì)組織剪成1mm×1mm×1mm大小組織塊,種于培養(yǎng)瓶內(nèi),加入1.5ml15%DMEM/F12培養(yǎng)基,置37。C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天換液一次。待細(xì)胞長至80%匯合時(shí)傳代培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)并繪制生長曲線,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物(CD29、CD44、CD34、CD45),并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)及成脂誘導(dǎo),觀察細(xì)胞成骨能力和脂滴形成情況。(2)人牙髓細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及鑒定取12-20歲患者因正畸減數(shù)拔除的前磨牙,在超凈臺(tái)內(nèi)清洗干凈,敲碎牙齒取出牙髓,剪去根尖部分,將剩余牙髓剪成1mm×1mm×1mm大小組織塊,種于培養(yǎng)瓶內(nèi),加入1.5ml 15%DMEM/F12培養(yǎng)基,置37。C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天換液一次。待細(xì)胞長至80%匯合時(shí)傳代培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)并繪制生長曲線,檢測角蛋白和波形絲蛋白鑒定細(xì)胞來源。(3)直接共培養(yǎng)后對細(xì)胞生物性能的影響先用BMP2誘導(dǎo)液誘導(dǎo)DPCs14天,通過q PCR檢測DSPP、ALP、DMP1 m RNA表達(dá)量分析其牙向分化能力。將hUCMSCs與誘導(dǎo)后DPCs的細(xì)胞按1:1、1:5、5:1的比例共培養(yǎng),同時(shí)各自單獨(dú)培養(yǎng),第7天、14天分別檢測DSPP、ALP、DMP1、OCN、Nanog、VEGF、HGF m RNA表達(dá)量,比較各組基因表達(dá)情況,綜合所有基因表達(dá)結(jié)果,選擇1:1組培養(yǎng)21天后進(jìn)行茜素紅染色,酶標(biāo)儀于562nm處檢測沉淀物形成情況;選擇1:1組進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:(1)分離培養(yǎng)以及鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法第5天開始有細(xì)胞從組織塊爬出,呈梭形、多角形,12天后達(dá)到80%匯合。細(xì)胞增殖速度快,呈成纖維細(xì)胞狀排列。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD29、CD44均呈陽性表達(dá),CD34、CD45均呈陰性表達(dá);成骨及成脂誘導(dǎo)后分別有鈣化結(jié)節(jié)以及脂滴的形成。(2)分離培養(yǎng)以及鑒定人牙髓細(xì)胞組織塊植入瓶后第3天細(xì)胞開始爬出,呈梭形,胞質(zhì)豐富、核圓、居中,10天后即可傳代。傳代后細(xì)胞增殖速度快。免疫組化染色顯示波形絲蛋白陽性表達(dá),角蛋白陰性。(3)BMP2誘導(dǎo)DPCs14天后,其DSPP、ALP、DMP1基因m RNA表達(dá)量高于誘導(dǎo)前(P0.05)。兩種細(xì)胞共培養(yǎng)后,共培養(yǎng)組的DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF m RNA表達(dá)量均高于hUCMSCs組(P0.05),NANOG m RNA的表達(dá)量均低于hUCMSCs組(P0.05)。茜素紅染色結(jié)果顯示:1:1組的OD值高于hUCMSCs組(P0.05),與DPCs組接近。細(xì)胞增殖結(jié)果顯示1:1組增殖速度快。結(jié)論:(1)臍帶組織塊培養(yǎng)法可以獲取完整的細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測以及成骨、成脂誘導(dǎo),所獲取細(xì)胞符合hUCMSCs生物學(xué)特征。(2)牙髓組織塊培養(yǎng)法所獲取細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色,結(jié)果顯示細(xì)胞符合DPCs生物學(xué)特征。(3)將hUCMSCs與經(jīng)BMP2誘導(dǎo)后的DPCs以1:1直接共培養(yǎng),細(xì)胞增殖速度快,促進(jìn)hUCMSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化以及血管形成相關(guān)因子的表達(dá)。初步探討了hUCMSCs具有作為牙髓再生的種子細(xì)胞的能力。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1265677