本文關(guān)鍵詞：VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性作用于維生素K1及對華法林對映異構(gòu)體濃度和藥效學(xué)指標(biāo)影響的研究

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【摘要】：目的:華法林(Warfarin,WF)是目前應(yīng)用廣泛的口服抗凝血藥,由于WF的有效治療范圍狹窄,個體間劑量差異大,有效劑量不易控制,故臨床主要以凝血酶原時間(prothrombin time,PT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(international normalized ratio,INR)作為其抗凝監(jiān)測指標(biāo)。WF用藥劑量受很多因素的影響,包括:維生素K的攝入、種族、年齡、合并用藥、體重指數(shù)以及遺傳基因等方面的因素。本研究通過分析遺傳基因(VKORC1和CYP4F2)和維生素K1(VitaminK1,VK1)對WF的劑量反應(yīng)的作用、血漿中VK1濃度和CYP4F2基因多態(tài)性以及與VKORC1的相關(guān)性,嘗試揭示體內(nèi)VK1的濃度與WF敏感指數(shù)的關(guān)系,為今后WF在臨床上的個體化給藥提供參考,以期達(dá)到提高抗凝控制率、減少出血風(fēng)險、增強臨床醫(yī)生使用WF治療信心的目的。方法:血漿VK1的HPLC-MS/MS檢測方法:采用APCI源正離子模式,穩(wěn)定性同位素標(biāo)記物(VitaminK1-d7)為內(nèi)標(biāo)定量,VK1和內(nèi)標(biāo)的檢測離子對質(zhì)荷比分別為m/z:451.0→187.0和458.6→194.4,乙醇沉淀蛋白,環(huán)己烷為萃取劑進(jìn)行液液萃取,使用Synergl 4u Fusion-RP C18(2.1mm×100mm,2.5μm)進(jìn)行色譜分離,流動相為A:B=水(0.05%甲酸):甲醇,梯度洗脫程序,流速0.3mL/min;血漿WF對映異構(gòu)體的HPLC-MS/MS檢測方法:采用ESI源負(fù)離子模式,萘普生為內(nèi)標(biāo)定量,WF和內(nèi)標(biāo)的檢測離子對質(zhì)荷比分別為m/z:307.2→160.9和228.9→185.1,1mol/L鹽酸作為緩沖環(huán)境,乙酸乙酯液液萃取。通過Lux Cellulose-3手性色譜柱(2.1mm×100mm,2μm)分離WF對映異構(gòu)體和內(nèi)標(biāo),A:B=水(0.5%甲酸):甲醇,流速:0.2mL/min;臨床樣本的收集、采集以及檢測:收集南京東南大學(xué)附屬醫(yī)院正常使用WF達(dá)到穩(wěn)定劑量的房顫患者21例作為觀察組,選擇同期健康受試者55例作為對照組,統(tǒng)一給予實驗標(biāo)準(zhǔn)餐。患者納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者穩(wěn)定抗凝至少3個月(抗凝水平在治療窗以內(nèi));(2)抽血前一個月有穩(wěn)定的日常WF劑量。排除標(biāo)準(zhǔn):有和胺碘酮以及抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用的。WF抗凝治療方案:初始劑量1~3mg,根據(jù)INR調(diào)整劑量。觀察組實驗清晨空腹抽取WF給藥前谷濃度外周血9.0mL,對照組空腹抽取外周血5.0mL。分別檢測每位患者血漿中VK1以及WF對映異構(gòu)體濃度、凝血因子水平、PT/INR、VKORC1、CYP4F2、CYP2C9基因型;檢測每位健康受試者血漿中VK1和VKORC1、CYP4F2基因型。根據(jù)所測得VK1和WF對映異構(gòu)體濃度,結(jié)合VKORC1和CYP4F2基因型和凝血因子水平、PT-INR,采用Origin統(tǒng)計學(xué)軟件對基因多態(tài)性和VK1與WF對映異構(gòu)體濃度和藥效學(xué)指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果:研究建立的檢測血漿中VK1和WF對映異構(gòu)體濃度的HPLC-MS/MS測定方法通過方法學(xué)考察,證明準(zhǔn)確、可靠。由于樣品量有限和WF個體差異大等因素,研究中雖未發(fā)現(xiàn)患者血漿中VK1濃度和WF敏感指數(shù)顯著性相關(guān),但在中國部分漢族人群中證明了VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性顯著地影響血漿中VK1濃度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶VKORC1G/A基因型的患者VK1濃度顯著性的高于攜帶A/A基因型的患者(p0.05);攜帶CYP4F2C/T和T/T基因型的患者VK1濃度顯著性的高于攜帶C/C基因型的患者(p0.05)。而健康受試者中,VKORC1基因多態(tài)性和VK1的濃度的相關(guān)性不顯著,但CYP4F2(T/T+C/T)基因型的VK1濃度顯著高于C/C基因型(p0.05)。結(jié)合文獻(xiàn)提示臨床醫(yī)生在WF的治療過程中,攜帶VKORC1G/G+CYP4F2T/T基因型的患者有較寬的WF治療窗,相對安全;攜帶VKORC1G/A+CYP4F2C/T基因型的患者使用WF時要監(jiān)測INR,不斷調(diào)整WF個體用藥,以達(dá)到安全用藥的目的;值得注意的是攜帶VKORC1A/A+CYP4F2C/C基因型的患者對WF劑量特別敏感,臨床中不僅要實時檢測INR;還需要通過調(diào)整飲食,嚴(yán)格控制VK1的攝入量;必要時換用新型口服抗凝藥保證患者的用藥安全。結(jié)論:建立的HPLC-MS/MS測定血漿中VK1和WF對映異構(gòu)體濃度的方法已成功運用到檢測房顫患者的VK1和WF對映異構(gòu)體濃度的臨床試驗中,且方法簡單易行,值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。在中國漢族人群中首次證明了VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性顯著地影響血漿中VK1濃度。本研究結(jié)果建議在使用WF時要注意VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性、維生素K1水平以及INR、凝血因子水平等因素的影響,以更好更快地發(fā)揮WF的抗凝作用。
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R969

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本文編號：1263863