本文關(guān)鍵詞：依賴于H3K27修飾的linc00441和RB1的雙向轉(zhuǎn)錄在肝細(xì)胞性肝癌的作用研究

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【摘要】：原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上常見的惡性腫瘤之一,其具有起病隱匿、惡性程度高、進(jìn)展迅速、易轉(zhuǎn)移、病死率高、總體預(yù)后不佳等特點(diǎn)。最新統(tǒng)計(jì)顯示,全球每年新發(fā)肝癌病例多達(dá)78萬例,并且每年約75萬例死于該病。在我國,肝癌發(fā)病人數(shù)約占世界總?cè)藬?shù)的一半,所以肝癌是威脅我國人民健康和生命的一大殺手。目前手術(shù)治療仍然是治療肝癌最主要最有效的方法,但是由于肝癌發(fā)病速度快,早期患者沒有明顯的癥狀了,確診時(shí)往往是屬于肝癌晚期,錯(cuò)過了最佳的手術(shù)時(shí)期。因此,探索肝癌發(fā)生發(fā)展以及其早期轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制對于肝癌早期診斷及提高肝癌患者預(yù)后具有十分重要的價(jià)值。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和完善,一些原本被認(rèn)為是"垃圾基因"的大量非編碼RNA及其在生物體內(nèi)的作用被不斷地闡明。長鏈非編碼RNA(long non-codingRNA,lncRNA)作為非編碼RNA中的重要一員,是一類不編碼蛋白的,轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子。其參與包括基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)等重要生命活動(dòng)過程,此外其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也扮演者重要的角色。在人類基因組中,有近11%的基因是以"頭對頭"的方式排列,并被同一個(gè)啟動(dòng)子雙向調(diào)控,這其中就包括LncRNA和編碼蛋白基因配對。大多數(shù)的雙向啟動(dòng)子調(diào)控方式是共表達(dá),而有少部分會(huì)產(chǎn)生相反的作用。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1(RB1)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,大量研究表明,RB1基因的抑癌作用與多種腫瘤的細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、衰老、凋亡等調(diào)控密切相關(guān)。本研究基于前人的大量研究結(jié)果,聚焦與RB1共用同一啟動(dòng)子的長鏈非編碼RNA00441,探究lnc00441是否能夠通過調(diào)控RB1的表達(dá)從而影響肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量測序技術(shù),生物信息學(xué)分析,經(jīng)典分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)等方法在體外肝癌細(xì)胞水平,體內(nèi)裸鼠模型水平和臨床肝癌組織中對linc00441通過對RB1調(diào)控從而影響肝癌發(fā)生發(fā)展過程中生物學(xué)行為和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行較為深入的研究。研究發(fā)現(xiàn):1、長鏈非編碼RNA00441在肝癌中異常高表達(dá),并且與RB1在肝癌細(xì)胞系中位置有相關(guān)性,同時(shí)與患者的臨床病例指標(biāo)密切相關(guān).首先我們利用qRT-PCR的方法,在80對肝癌和癌旁組織及16個(gè)正常肝組織中檢測lnc00441及RB1的表達(dá)量,我們發(fā)現(xiàn)相對于癌旁和正常肝組織肝癌組織中的lnc00441表達(dá)異常增高,而RB1的表達(dá)量反而減少。Pearson相關(guān)性分析表明二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。原位雜交實(shí)驗(yàn)(ISH)表明lnc00441與RB1在肝癌細(xì)胞系中存在表達(dá)位置上的相關(guān)性,表明二者空間位置的相關(guān)性。此外臨床資料分析顯示高表達(dá)lnc00441的病人往往表現(xiàn)為更大的腫瘤。2、lnc00441可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖能力。我們通過慢病毒系統(tǒng)敲除和過表達(dá)lnc00441,從肝癌細(xì)胞系水平檢測經(jīng)過處理后的肝癌細(xì)胞系的增殖能力,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)lnc00441的肝癌細(xì)胞G1期比例明顯減少從而有更強(qiáng)的增殖能力。同時(shí)利用裸鼠模型的皮下瘤實(shí)驗(yàn)表明,在體內(nèi)的環(huán)境下,過表達(dá)的lnc00441能產(chǎn)生和在細(xì)胞系里一樣的趨勢。3、肝癌組織中l(wèi)nc00441異常高表達(dá)及其調(diào)控RB1低表達(dá)的具體機(jī)制。結(jié)合生物信息學(xué)分析與已發(fā)表文獻(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)lnc00441與RB1公用同一啟動(dòng)子,但二者在肝癌組織中的表達(dá)趨勢卻相反。通過RNA蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(RIP),我們發(fā)現(xiàn)lnc00441可與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)相結(jié)合,并且在高表達(dá)lnc00441的肝癌組織中RB1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)前啟動(dòng)子區(qū)DNA存在更高的CpG島甲基化率,并且可被甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑所抑制。這表明lnc00441可通過招募DNMT3A來促進(jìn)RB1啟動(dòng)子區(qū)域CpG的甲基化從而抑制RB1的表達(dá)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)lnc00441的肝癌細(xì)胞中前啟動(dòng)區(qū)有更高的H3K27乙酰化率,并且被轉(zhuǎn)錄因子TCF-4所調(diào)節(jié)。綜上所述,我們第一次闡述了 lnc00441可以通過調(diào)節(jié)其附近的RB1的表達(dá)來影響肝癌的進(jìn)展,深入探討了 lnc00441在肝癌組織中異常高表達(dá)及其調(diào)控RB1基因低表達(dá)的具體機(jī)制。豐富了 lncRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。為肝癌的早期診斷、預(yù)后的判斷提供了新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Roberto Mazzanti;Umberto Arena;Renato Tassi;;Hepatocellular carcinoma: Where are we?[J];World Journal of Experimental Medicine;2016年01期

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本文編號(hào)：1262346