本文關(guān)鍵詞：基于CHA技術(shù)用于單增李斯特菌的新型可視化檢測方法建立

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【摘要】：李斯特菌在我們的生活環(huán)境中無處不在,絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。肉、蛋蔬菜等常見食物都已表明是李斯特菌的感染源。李斯特菌可引起嚴(yán)重的疾病感染,許多國家已對食品中的李斯特菌采取相應(yīng)控制措施,因此其檢測方法也是各國關(guān)注的焦點之一。檢測方法從傳統(tǒng)常規(guī)的分離培養(yǎng)法到免疫學(xué)檢測方法,發(fā)展到如今的現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測技術(shù)。傳統(tǒng)常規(guī)方法受到耗時長,所需儀器復(fù)雜,需要輔助酶等條件的限制。等溫擴增CHA(Catalyzed hairpin assembly)是近期發(fā)展的現(xiàn)代分子學(xué)中新型核酸探針信號放大技術(shù),常溫?zé)o酶條件下即可實現(xiàn)對核酸靶標(biāo)的便攜、靈敏的檢測。本研究利用CHA技術(shù)并結(jié)合不同的可視化信號輸出方式,對單增李斯特菌進(jìn)行特異檢測。本研究的主要內(nèi)容如下:(1)基于CHA和試紙條建立李斯特菌可視化檢測方法基于核酸CHA恒溫擴增和試紙條,建立李斯特菌可視化檢測的新方法。CHA的兩個發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針H1和H2的5’(或3’)端分別標(biāo)記Fitc和Biotin,當(dāng)靶標(biāo)DNA存在時,試紙條檢測線上留下紅線標(biāo)記,并且標(biāo)記的顏色強度與靶標(biāo)DNA的濃度在200p M-1n M濃度范圍內(nèi)成線性相關(guān)。該方法的檢測限可達(dá)到36.4 p M,該方法可在常溫?zé)o酶條件下進(jìn)行,靈敏好,特異性強。(2)基于CHA和DNAzyme技術(shù)對李斯特菌可視化檢測基于CHA及DNAzyme建立李斯特菌可視化檢測的新方法。CHA一條發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針莖部包裹固定G-四鏈體發(fā)夾型序列。引發(fā)發(fā)夾結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)DNA結(jié)合時,釋放出的引發(fā)鏈啟動CHA反應(yīng),并打開被包裹住的G-四鏈體結(jié)構(gòu),Hemin激活其活性,加入ABTS和H2O2后并發(fā)生顯色反應(yīng),從而實現(xiàn)對靶標(biāo)DNA的可視化檢測。其檢測限可以達(dá)到60.7 p M。該方法無需任何標(biāo)記,成本低廉,設(shè)計簡便,同時將靶標(biāo)核酸互補片段固定在抓取探針發(fā)夾環(huán)部分,有效的增加實用性和通用性。(3)基于CHA和DSN酶的雙重信號放大建立李斯特菌檢測方法基于CHA和DSN酶的雙重放大檢測方法,DNAzyme作為可視化信號輸出方式,檢測限達(dá)到了434 f M。本方法通過DSN酶輔助的信號擴增結(jié)合CHA恒溫信號擴增反應(yīng),在發(fā)夾型結(jié)構(gòu)探針中固定G-四鏈體結(jié)構(gòu),在靶標(biāo)底物存在的條件下,DSN酶可成功作用于DNA-RNA雙鏈,釋放CHA引發(fā)鏈,從而引發(fā)CHA反應(yīng),產(chǎn)生顯色變化。本檢測平臺具有雙重放大效果,靈敏度高,特異性強。綜上所述,本文成功建立了基于CHA技術(shù)用于單增李斯特菌核酸特異性檢測的放大平臺,實現(xiàn)了特異檢測單增李斯特菌,操作簡便,成本低廉,抗干擾能力強,檢測限可以達(dá)到f M,有利于建立低成本快速實樣篩選檢測,為今后新型檢測方法打下良好基礎(chǔ),在臨床診斷、食品衛(wèi)生檢驗等領(lǐng)域具有廣闊的前景。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R155.5

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本文編號：1260118