本文關(guān)鍵詞：基于熱敏通道TRPV1、TRPA1探討吳茱萸湯的散寒止痛機(jī)理

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【摘要】：背景:吳茱萸湯是《傷寒論》中的名方,《方劑學(xué)》將其收入溫里劑。該方由吳茱萸、人參、生姜、大棗組成,具有溫中補(bǔ)虛,降逆止嘔的功用,主治陽明寒嘔、少陰吐利和厥陰頭痛,現(xiàn)多用于治療消化性疾病如食道反流、消化性潰瘍、淺表性胃炎等病屬于虛寒之證者�，F(xiàn)代研究證明寒熱感受是通過熱敏通道介導(dǎo)的,熱敏通道在寒熱相關(guān)的疼痛中也發(fā)揮核心作用。既有研究表明,吳茱萸湯包含吳茱萸堿、吳茱萸次堿和姜酚等至少7種TRPV1/TRPA1激動(dòng)劑。熱通道的激動(dòng)劑通過活化TRPV1可以交叉脫敏寒通道TRPA1引起的冷痛。吳茱萸湯可能通過該機(jī)制發(fā)揮溫中散寒止痛的作用。內(nèi)臟疼痛作為一種常見的內(nèi)臟感覺,是許多疾病共有的癥狀。內(nèi)臟的冷痛主要是內(nèi)臟感覺神經(jīng)末梢上寒通道活化的結(jié)果,因此寒通道的激動(dòng)劑可以模擬內(nèi)臟的冷痛,而熱通道的活化和脫敏可以消除這種疼痛。本研究在體外(細(xì)胞)和體內(nèi)(小鼠)模型上,采用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)、免疫組織化學(xué)、免疫蛋白印跡(western blot)技術(shù)以及動(dòng)物行為學(xué)方法,探討熱敏通道在吳茱萸湯溫中散寒止痛中所發(fā)揮的作用。研究目的:吳茱萸湯散寒止痛的機(jī)制研究。研究方法:1.在轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細(xì)胞上,運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測量吳茱萸湯中的部分標(biāo)志性成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿、10-姜酚分別或配伍對熱敏通道TRPV1跨膜電流的影響。2.在TRPA1激動(dòng)劑芥子油介導(dǎo)的小鼠內(nèi)臟疼痛模型上,觀察吳茱萸湯及其拆方對小鼠疼痛行為的影響。3.在TRPA1激動(dòng)劑芥子油介導(dǎo)的小鼠內(nèi)臟疼痛模型上,應(yīng)用免疫組化及免疫蛋白印跡(western blot)技術(shù),檢測TRPA1與TRPV1在模型小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)。結(jié)果:1.全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞外液對比,吳茱萸堿、吳茱萸次堿和10-姜酚均能誘導(dǎo)TRPV1/HEK293細(xì)胞產(chǎn)生明顯跨膜電流,吳茱萸堿誘導(dǎo)的跨膜電流是辣椒素誘導(dǎo)的跨膜電流的1/3。吳茱萸堿在1μ M,10 μM,30 μM,50 μM這四個(gè)濃度下產(chǎn)生的跨膜電流無顯著差異(P0.05)。10M10-姜酚和50μM濃度下產(chǎn)生的跨膜電流無顯著差異,但與1μM濃度下誘導(dǎo)的跨膜電流差異顯著(P0.01)。1μM吳茱萸次堿產(chǎn)生的跨膜電流約為10μM產(chǎn)生的跨膜電流的一半。11μM的吳茱萸堿和相同濃度的10-姜酚產(chǎn)生的跨膜電流相當(dāng)(P0.05),但是明顯高于相同濃度下吳茱萸次堿誘導(dǎo)的電流。10 μM10-姜酚+10 μ M吳茱萸堿配伍產(chǎn)生的跨膜電流明顯高于10 μ M吳茱萸堿單獨(dú)使用產(chǎn)生的跨膜電流(P0.001),同時(shí)也明顯高于10 μM10-姜酚單獨(dú)使用產(chǎn)生的跨膜電流(P0.05)。另一個(gè)組合10 μM10-姜酚+10 μ M吳茱萸次堿誘導(dǎo)產(chǎn)生的電流也高于10 uM吳茱萸次堿或10 μ M10-姜酚單獨(dú)使用產(chǎn)生的跨膜電流(P0.05)。吳茱萸堿+10-姜酚和吳茱萸次堿+10-姜酚這兩個(gè)不同組合誘導(dǎo)產(chǎn)生的跨膜電流都能被辣椒平(TRPV1通道特異性拮抗劑)完全阻斷。吳茱萸堿預(yù)處理后可明顯抑制10-姜酚誘導(dǎo)產(chǎn)生的電流(P0.001)和10-姜酚+吳茱萸堿誘導(dǎo)產(chǎn)生的電流(P0.01)。吳茱萸堿預(yù)處理后,30μM辣椒素誘導(dǎo)產(chǎn)生的跨膜電流與單獨(dú)使用對比顯著減少(P0.001)。2.動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)不同劑量的吳茱萸湯對小鼠疼痛行為的影響。模型組小鼠的疼痛行為頻次明顯高于正常組。預(yù)處理4天后,與模型組對比,吳茱萸湯各劑量給藥組疼痛行為頻次明顯降低。其中,高劑量組與中劑量組疼痛行為頻次對比無顯著差異(P0.05),但都低于低劑量組疼痛行為頻次,差異顯著(P0.05)。造模后,小鼠疼痛行為出現(xiàn)時(shí)間顯著縮短(30s以內(nèi)),與正常組(100s左右)對比差異極顯著(P0.001)。吳茱萸湯高、中、低三個(gè)劑量組均能推遲小鼠疼痛行為出現(xiàn)時(shí)間,與模型組對比差異極顯著(P0.001)。吳茱萸湯全方及拆方對小鼠疼痛行為的影響。預(yù)處理4天后,布洛芬陽性對照組、吳茱萸湯組、吳茱萸+生姜組、吳茱萸組、生姜組小鼠疼痛行為頻次明顯降低,與模型組對比差異顯著。吳茱萸組、生姜組疼痛行為出現(xiàn)時(shí)間與模型組對比無顯著差異(P0.05)。吳茱萸湯全方疼痛行為出現(xiàn)時(shí)間遲于吳茱萸+生姜組,差異顯著(P0.01)。大棗+人參組無論在疼痛行為頻次還是疼痛行為出現(xiàn)時(shí)間與模型組對比均無顯著差異(P0.05)。吳茱萸湯在不同時(shí)間預(yù)處理對小鼠疼痛行為的影響。各實(shí)驗(yàn)組給藥后,吳茱萸湯預(yù)處理2h、4h及吳茱萸+生姜水煎液預(yù)處理2h、4h均可顯著降低小鼠的疼痛行為,與模型組對比差異極顯著(P0.001)。吳茱萸+生姜水煎液預(yù)處理1 h可降低疼痛行為頻次,與模型組對比差異顯著(P0.05)。然而,吳茱萸湯預(yù)處理1h對小鼠的疼痛行為頻次無明顯影響,與模型組對比無顯著差異(P0.05)。吳茱萸湯預(yù)處理1h,2h和吳茱萸+生姜水煎液預(yù)處理1h,2h可以明顯推遲小鼠疼痛行為出現(xiàn)時(shí)間,與模型組對比差異顯著。吳茱萸湯及吳茱萸+生姜組預(yù)處理4h疼痛行為出現(xiàn)時(shí)間與模型組對比無顯著差異(P0.05)。吳茱萸湯與幾種拮抗劑使用對小鼠疼痛行為的影響。釕紅、辣椒平、昂丹司瓊等藥物單獨(dú)預(yù)處理內(nèi)臟疼痛行為頻次與模型組對比無顯著差異(P0.05)。同時(shí),釕紅、辣椒平、昂丹司瓊分別與吳茱萸湯聯(lián)合使用后疼痛行為頻次與模型組也無顯著差異(P0.05)。然而,納洛酮單獨(dú)使用和與吳茱萸湯聯(lián)合使用小鼠內(nèi)臟疼痛行為頻次降低,與模型組差異顯著。3.免疫組化及免疫蛋白印跡(western blot)實(shí)驗(yàn)吳茱萸湯對小鼠腸道TRPV1/TRPA1表達(dá)的影響。吳茱萸湯1次性給藥1h后結(jié)腸組織中TRPV1表達(dá)明顯高于正常組(P0.001)。給藥2h后,TRPV1表達(dá)明顯低于給藥1h組(P0.01)。模型組小鼠結(jié)腸組織中TRPA1表達(dá)明顯高于正常組,差異顯著。吳茱萸湯和布洛芬預(yù)處理2h后能使小鼠結(jié)腸組織中TRPA1表達(dá)下調(diào),與模型組對比差異顯著(P0.01)。辣椒平預(yù)處理對小鼠結(jié)腸組織中TRPA1表達(dá)無明顯影響,與模型組對比無顯著差異(P0.05)。辣椒平聯(lián)合吳茱萸湯預(yù)處理可上調(diào)吳茱萸湯結(jié)腸組織中TRPA1陽性表達(dá),與單獨(dú)用吳茱萸湯對比差異顯著,與模型組對比無顯著差異(P0.05)。結(jié)論及意義:1.吳茱萸湯中的吳茱萸堿、吳茱萸次堿、10-姜酚是熱敏通道TRPV1的激動(dòng)劑。它們之間的配伍可以增強(qiáng)對TRPV1的作用。2.熱敏通道TRPV1、TRPA1是吳茱萸湯發(fā)揮散寒止痛作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1259905