本文關(guān)鍵詞：miR-503通過靶向PI3K p85調(diào)節(jié)上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化

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【摘要】：矽肺病(Silicosis)是在生產(chǎn)過程中長期過量吸入含有較高濃度的結(jié)晶型游離二氧化硅(silicondioxide,SiO2)粉塵引起的以肺組織不可逆性纖維化為主的全身性疾病,是我國最嚴重的職業(yè)病之一。矽肺病患者早期臨床癥狀較輕或不明顯,隨著病情的發(fā)展可出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、胸悶等臨床表現(xiàn)。矽肺的基本病理改變是矽結(jié)節(jié)的形成和肺間質(zhì)的廣泛纖維化。大量的研究也表明其病理機制可能有上皮組織化生與凋亡、纖維母細胞的募集、成纖維細胞的增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過度沉積等。由于矽肺病的發(fā)病機制并未完全清楚,目前尚無特效治療方法。但隨著科學(xué)的發(fā)展和研究的深入,越來越多的證據(jù)表明microRNAs(miRNAs,miRs)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在纖維化疾病(包括矽肺病)的發(fā)病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。EMT是具有極性且相連的上皮細胞轉(zhuǎn)化為非極性且缺乏細胞間連接的間充質(zhì)細胞的過程,這一過程可以增強細胞的運動性或遷移性。在促纖維化細胞因子的作用下,肺泡II型上皮細胞(Alveolar type Ⅱ epithelial cells,AT2)會通過EMT的過程轉(zhuǎn)化為肺間質(zhì)細胞,如成纖維細胞和肌成纖維細胞等,從而促進纖維化的發(fā)展。在發(fā)生EMT過程中,上皮細胞也逐漸失去上皮表型(丟失上皮標志物如E-cadherin、ZO-1等的表達),并逐漸獲得間充質(zhì)細胞的表型(表達間充質(zhì)細胞標志物如α-SMA、vimentin等)。miRNAs是一系列長度為18-22個核苷酸的小的非編碼RNAs。其生物學(xué)功能主要是通過靶定基因的3'-非編碼區(qū)(3'-untranslatedregion,3'-UTR),抑制其靶基因信使RNA(messenger RNA,mRNA)的翻譯或降解,從而調(diào)節(jié)基因的表達。越來越多的研究表明在肺纖維化過程中,miRNAs可以通過靶定纖維化相關(guān)基因或EMT相關(guān)基因,發(fā)揮促進或抑制纖維化的作用。長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類長度超過 200個核苷酸序列的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄子。大量的研究證實lncRNAs可以調(diào)節(jié)細胞的增殖分化、轉(zhuǎn)移以及EMT過程。近年來研究lncRNAs功能最多的是其可作為miRNAs的分子"海綿"吸附miRNAs,從而可以調(diào)控miRNAs的活性。具有"海綿"吸附功能的lncRNAs也被人命名為競爭性內(nèi)源RNAs(competing endogenous RNAs,ceRNAs)。已有研究表明lncRNAs可以通過調(diào)節(jié)miRNAs的表達在小鼠肺纖維化模型中調(diào)控EMT的過程。我們之前的芯片研究發(fā)現(xiàn)miR-503在矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化組織中的表達降低,并在后續(xù)的驗證實驗中得到了證實,在動物水平上調(diào)miR-503可明顯抑制矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化。為了探討miR-503減輕矽肺纖維化的作用機制,我們利用小鼠矽肺體內(nèi)模型以及支氣管與肺泡上皮細胞(HBE和A549)的體外模型,研究miR-503在矽肺纖維化中影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制及其調(diào)控因素。目的:通過建立矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化體內(nèi)模型、細胞體外模型,以及在體內(nèi)和體外模型中進行miR-503的干涉,探討miR-503抑制矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化可能的分子機制,為miRNA在矽肺病治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法:(1)建立矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型:設(shè)立空白對照組、生理鹽水組以及不同時間點(7天、14天、28天)的矽塵組,以氣管內(nèi)灌注生理鹽水粉塵懸濁液的方法建立小鼠矽肺模型,通過肺組織病理切片HE染色觀察小鼠肺纖維化病變的變化過程。(2)利用SiO2粉塵懸濁液處理HBE和A549細胞建立體外模型,顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變。(3)qRT-PCR法檢測體內(nèi)和體外模型中不同時間和濃度下組織和細胞中miR-503表達的改變;Western blot法檢測體內(nèi)和體外模型不同時間和濃度的組織和細胞中EMT標志物(上皮標志物:E-cadherin;間充質(zhì)標志物:vimentin、α-SMA)表達的改變,使用免疫熒光觀察SiO2處理的HBE細胞中α-SMA表達的改變。(4)使用agomir-503或miR-503 mimic聯(lián)合矽塵分別構(gòu)建miR-503干預(yù)的小鼠動物模型和HBE、A549細胞模型,肺組織切片的HE染色觀察小鼠肺組織的纖維化程度,使用qRT-PCR法檢測肺組織和細胞中miR-503的表達水平,使用Western-blot法檢測肺組織和細胞中EMT標志物表達的改變。(5)通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)合文獻選取了 miR-503的靶基因PI3K p85,并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實兩者的結(jié)合;通過siRNA干涉PI3K p85的表達,使用Western blot法檢測其敲除效率和下游分子Akt、Snail的表達以及EMT標志物表達的改變情況。(6)通過回復(fù)實驗,在HBE和A549細胞中同時轉(zhuǎn)染miR-503 mimic和PI3Kp85的過表達質(zhì)粒進一步證實兩者的調(diào)控關(guān)系,使用Western blot法檢測PI3K p85、下游分子Akt和Snail以及EMT標志物表達的改變。(7)通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測到lncRNAMALAT1可能與miR-503存在結(jié)合,利用RNA pull-down和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實兩者的結(jié)合;在細胞中使用siRNA敲除lncRNAMALAT1,通過qRT-PCR檢測敲除效率及敲除lncRNAMALAT1后miR-503表達的改變,Western blot法檢測敲除lncRNA MALAT1后miR-503的靶基因PI3K p85,下游分子Akt、Snail及EMT標志物表達的改變。結(jié)果1.小鼠矽肺組織中miR-503的表達降低病理切片HE染色結(jié)果顯示,隨著染塵天數(shù)的增加,纖維化的嚴重程度也逐漸增加,在第14天時有較小的矽結(jié)節(jié)產(chǎn)生,在第28天時即出現(xiàn)典型的"蔥頭樣"矽結(jié)節(jié)。Western blot肺組織的檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn)隨著染塵時間的延長上皮標志物E-cadherin的表達逐漸降低,而間充質(zhì)標志物vimentin和α-SMA的表達逐漸升高。對肺組織的qRT-PCR檢測結(jié)果顯示隨著染塵時間的增加,肺組織中miR-503的表達水平逐漸降低。2.在小鼠體內(nèi)升高miR-503可以減輕EMT病理切片的HE染色結(jié)果顯示高表達miR-503組纖維化的嚴重程度相比于miR-NC對照組明顯減輕,所有病理切片的纖維化評分結(jié)果也顯示無論是嚴重程度還是分布范圍,高表達miR-503組相比于miR-NC對照組都明顯降低,且具有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot檢測結(jié)果顯示高表達miR-503可以升高上皮標志物E-cadherin的表達,降低間充質(zhì)標志物vimentin和α-SMA的表達。這也提示miR-503在矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化中在一定程度上可以減輕EMT。3.miR-503通過靶向PI3K p85抑制EMT探究miR-503抑制EMT的作用機制,通過多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測到PI3Kp85存在與miR-503結(jié)合的潛在結(jié)合位點,并且也有文獻證實PI3K p85與EMT有關(guān)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)miR-503只能降低PI3Kp85野生型質(zhì)粒組的熒光素酶活性,從而證實了兩者的結(jié)合。Western blot檢測結(jié)果也顯示PI3K p85的表達水平與miR-503的表達水平呈負相關(guān)關(guān)系;用siRNA敲除PI3Kp85可以逆轉(zhuǎn)EMT過程;同時轉(zhuǎn)染miR-503 mimic和PI3Kp85的過表達質(zhì)粒的回復(fù)實驗結(jié)果顯示過表達PI3Kp85可以逆轉(zhuǎn)miR-503對于EMT的抑制作用。4.miR-503通過調(diào)控PI3K/Akt/Snail信號通路影響EMT進一步探索miR-503-PI3K p85影響EMT的信號通路,通過閱讀EMT通路相關(guān)文獻,選取了 PI3K p85的下游分子Akt和Snail進行研究。Western blot結(jié)果顯示,在小鼠矽肺模型以及細胞模型中,隨著染塵時間和染塵劑量的增加p-Akt和Snail的表達逐漸增加;在高表達miR-503的體內(nèi)和體外模型以及敲除PI3Kp85的細胞實驗中,p-Akt和Snail的表達也受到抑制;回復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)過表達PI3Kp85可以逆轉(zhuǎn)高表達miR-503對p-Akt和Snail的抑制作用。5.lncRNA MALAT1通過吸附miR-503調(diào)節(jié)EMT探索miR-503受調(diào)控及在矽肺中表達降低的因素。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測到lncRNA MALAT1與miR-503存在潛在結(jié)合位點。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示在矽塵處理的HBE和A549細胞中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達升高,與miR-503的表達趨勢相反。RNA pull-down和雙熒光素酶報告基因結(jié)果提示miR-503與lncRNAMALAT1之間存在結(jié)合。使用siRNA敲除lncRNA MALAT1,qRT-PCR結(jié)果顯示抑制lncRNA MALAT1的表達可以升高miR-503的表達;Western blot結(jié)果也顯示敲除lncRNA MALAT1可以抑制PI3K p85、p-Akt和Snail的表達水平并逆轉(zhuǎn)EMT過程。提示在矽肺中l(wèi)ncRNA MALAT1可以作為miR-503的"海綿"吸附miR-503,從而降低其表達水平。結(jié)論:以上結(jié)果提示miR-503可以抑制矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化,其機制主要是通過靶向作用于PI3Kp85,減弱了 Akt/Snail信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而抑制上皮細胞發(fā)生EMT。此外我們也發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1作為分子"海綿"可吸附miR-503,降低miR-503的表達,從而進一步影響下游PI3Kp85/Akt/Snail信號通路,進而導(dǎo)致EMT,促進矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R135.2

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