本文關(guān)鍵詞：組蛋白去甲基化酶JMJD3在SAHF形成中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： JMJD3 RB蛋白 SAHF 賴氨酸去甲基化 表觀遺傳修飾

【摘要】：細(xì)胞衰老是指細(xì)胞受到特定的刺激后進(jìn)入不可逆的細(xì)胞周期停滯的狀態(tài)。癌基因的誘導(dǎo)或者復(fù)制性衰老都可以引起人二倍體成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)重排,形成異染色質(zhì)凝集,這一現(xiàn)象被稱為衰老相關(guān)的異染色質(zhì)凝集(SAHF)。SAHF由細(xì)胞核內(nèi)的染色體重塑凝集形成致密的染色質(zhì)區(qū)域,每一條染色體形成一個(gè)凝集點(diǎn),能夠被DAPI染料識別出來。SAHF凝集點(diǎn)包含與基因沉默相關(guān)的H3K9me3、HP1蛋白、HMGA1蛋白、PML、marcoH2A等,并且將E2F靶基因也包裹在凝集點(diǎn)中,抑制了E2F靶基因的表達(dá)。研究表明,SAHF的形成抑制了與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因的表達(dá),并且一些癌細(xì)胞也能夠被誘導(dǎo)形成SAHF,這對于開發(fā)新的抗癌藥物提供了新的思路。但是目前對于SAHF組裝和維持的具體過程了解的還不是很透徹。RB蛋白對于細(xì)胞生命活動至關(guān)重要,許多癌癥的發(fā)生都與RB蛋白的突變有關(guān)。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)在SAHF的形成過程中,RB蛋白也發(fā)揮著重要功能,一些RB蛋白突變或者不能夠被激活的細(xì)胞系是不能夠形成SAHF的。據(jù)報(bào)道,RB蛋白可以發(fā)生多種翻譯后修飾,如乙�；�、泛素化、磷酸化、甲基化等,這些翻譯后修飾可以調(diào)控RB蛋白的功能。如Ser807/811的磷酸化調(diào)控著許多細(xì)胞生命活動,并且RB蛋白的甲基化可以影響其磷酸化。但是RB蛋白究竟是怎樣影響SAHF的形成的,其甲基化是否也會影響SAHF的形成過程尚不清楚。JMJD3蛋白屬于JMJD家族的一個(gè)組蛋白去甲基化酶,這個(gè)家族的成員都包含有JmjC結(jié)構(gòu)域。JMJD3調(diào)控了許多生命活動,比如胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的分化、巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞衰老等,JMJD3的異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道,在人和小鼠成纖維細(xì)胞中JMJD3能夠去除p16啟動子處和基因編碼區(qū)的H3K27me3,激活p16基因的表達(dá)。但是在我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),在p16基因缺失的細(xì)胞系MDA-MB-231中,外源過表達(dá)JMJD3依然能夠誘導(dǎo)細(xì)胞衰老并且形成SAHF。因此我們推測在JMJD3誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的過程中可能還存在一條不依賴p16的途徑。在本論文的研究中我們發(fā)現(xiàn),在WI38細(xì)胞中沉默JMJD3的表達(dá)會影響H-RasV12誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老以及SAHF形成,JMJD3的表達(dá)對SAHF的形成是必需的。JMJD3在H-RasV12誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老以及SAHF形成過程中表達(dá)上調(diào),在WI38細(xì)胞中過表達(dá)JMJD3可以誘導(dǎo)細(xì)胞形成SAHF,并且這一過程是需要其去甲基化酶活性的。免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)在SAHF形成過程中,JMJD3在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯上升,但是在細(xì)胞核中并沒有明顯的升高,蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)JMJD3能夠與RB蛋白相互作用,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)JMJD3通過其JmjC結(jié)構(gòu)域與RB蛋白的659-840結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合。體外甲基化-去甲基化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JMJD3能夠催化Set7/9介導(dǎo)的RB蛋白的甲基化位點(diǎn)去甲基化,并且確定了去甲基化的位點(diǎn)是RB蛋白第810位賴氨酸,表明組蛋白去甲基化酶JMJD3也可以催化非組蛋白去甲基化。隨后我們檢測出JMJD3的過表達(dá)以及干涉會影響RB蛋白與CDK4的結(jié)合情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明JMJD3催化RB去甲基化的作用抑制了CDK4與RB蛋白的結(jié)合,降低了RB蛋白S807/811的磷酸化水平,進(jìn)而抑制了E2F靶基因的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞衰老形成SAHF。本論文的研究結(jié)果表明,JMJD3是一個(gè)新的SAHF的誘導(dǎo)因子,JMJD3可以通過催化非組蛋白RB蛋白K810位去甲基化,促進(jìn)SAHF的形成。發(fā)現(xiàn)非組蛋白的翻譯后修飾參與細(xì)胞衰老和SAHF形成,為更好的了解SAHF形成的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：JMJD3 RB蛋白 SAHF 賴氨酸去甲基化 表觀遺傳修飾
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q343
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-11
• 第一部分 引言11-29
• 一、細(xì)胞衰老11-22
• （一）細(xì)胞衰老的特點(diǎn)及意義11-13
• （二）細(xì)胞衰老相關(guān)的異染色質(zhì)凝集13-16
• 1. SAHF簡介13-14
• 2. SAHF的形成過程14-16
• 3. SAHF形成中的表觀遺傳修飾16
• （三）與SAHF形成相關(guān)的信號通路16-18
• （四）細(xì)胞衰老的原因18-21
• （五）SAHF的形成與癌癥21-22
• 二、組蛋白去甲基化酶JMJD322-24
• （一）組蛋白去甲基化酶家族簡介22-23
• （二）組蛋白去甲基化酶JMJD3的功能簡介23-24
• 三、RB蛋白及其翻譯后修飾的功能及影響24-27
• （一）蛋白的翻譯后修飾24
• （二）RB蛋白介紹24-27
• 四、本論文研究的內(nèi)容及意義27-29
• （一）立題依據(jù)27
• （二）研究的內(nèi)容及意義27-29
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)材料及方法29-52
• 一、實(shí)驗(yàn)材料29-31
• （一）蛋白質(zhì)與抗體29-30
• （二）哺乳動物細(xì)胞系30
• （三）試劑30-31
• 二、實(shí)驗(yàn)方法31-52
• Ⅰ.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法31-41
• （一）質(zhì)粒構(gòu)建31
• （二）DNA瓊脂糖凝膠電泳31
• （三）質(zhì)粒大量制備方法31-32
• （四）哺乳動物細(xì)胞總RNA的提取方法及反轉(zhuǎn)錄PCR32-33
• （五）PCR及熒光實(shí)時(shí)定量PCR33-36
• （六）慢病毒干涉質(zhì)粒構(gòu)建36-37
• （七）Flag親和層析37
• （八）GST融合蛋白純化及GST Pull-down實(shí)驗(yàn)37-39
• （九）體外甲基化-去甲基化實(shí)驗(yàn)39-41
• Ⅱ.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法41-50
• （一）哺乳動物細(xì)胞系的培養(yǎng)41
• （二）PEI轉(zhuǎn)染41
• （三）逆病毒包裝及感染41-42
• （四）慢病毒包裝及感染42-43
• （五）Western Blotting檢測43-45
• （六）DAPI染色實(shí)驗(yàn)45-46
• （七）免疫熒光檢測46-47
• （八）衰老染色47
• （九）BrdU摻入47-48
• （十）細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核蛋白質(zhì)抽提48-49
• （十一）蛋白質(zhì)免疫共沉淀49-50
• Ⅲ.統(tǒng)計(jì)分析50-52
• 第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析52-72
• 一、干涉JMJD3表達(dá)抑制SAHF的形成52-54
• （一）JMJD3在H-RasV12誘導(dǎo)WI38細(xì)胞形成SAHF過程中表達(dá)上調(diào)52
• （二）干涉JMJD3逆轉(zhuǎn)H-RasV12誘導(dǎo)WI38細(xì)胞衰老52-53
• （三）沉默JMJD3后H-RasV12誘導(dǎo)WI38細(xì)胞形成SAHF比率下降53-54
• 二、過表達(dá)JMJD3誘導(dǎo)SAHF形成54-57
• （一）外源過表達(dá)JMJD3誘導(dǎo)WI38細(xì)胞衰老54-55
• （二）外源過表達(dá)JMJD3誘導(dǎo)WI38細(xì)胞形成SAHF55-57
• 三、JMJD3與RB蛋白相互作用57-62
• （一）JMJD3在SAHF形成過程中在細(xì)胞質(zhì)中聚集57-58
• （二）JMJD3與RB蛋白相互結(jié)合58-59
• （三）JMJD3通過其JmjC結(jié)構(gòu)域與RB蛋白相互作用59-62
• 1. RB蛋白能結(jié)合到JMJD3蛋白的JmjC結(jié)構(gòu)域59-60
• 2. RB蛋白的 659-840結(jié)構(gòu)域與Jmj C直接結(jié)合60-62
• 四、JMJD3能夠?qū)B蛋白K810位去甲基化62-67
• （一）JMJD3能夠催化RB蛋白去甲基化62
• （二）JMJD3能夠催化Set7/9 介導(dǎo)的RB蛋白甲基化位點(diǎn)去甲基化62-65
• （三）JMJD3催化RB去甲基化的位點(diǎn)是第810位65-67
• 五、JMJD3催化RB去甲基化從而抑制RB蛋白的磷酸化67-72
• （一）JMJD3抑制RB蛋白的磷酸化67-69
• （二）JMJD3抑制RB與CDK4的結(jié)合69
• （三）RB的去甲基化抑制E2F靶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)SAHF的形成69-72
• 第四部分 討論72-77
• 一、SAHF形成中的表觀遺傳修飾72-74
• 二、JMJD3誘導(dǎo)細(xì)胞形成SAHF不依賴于p16途徑74-75
• 三、RB蛋白甲基化-去甲基化修飾與磷酸化修飾之間的crosstalk75
• 四、RB蛋白的去甲基化影響部分E2F靶基因的表達(dá)75-76
• 五、JMJD3誘導(dǎo)SAHF形成的機(jī)制76-77
• 主要結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)77-78
• 一、主要結(jié)論77
• 二、主要創(chuàng)新點(diǎn)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-93
• 附錄93-96
• 致謝96-97
• 在校期間公開發(fā)表論文情況97

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