發(fā)布時間：2017-09-25 09:19

  本文關(guān)鍵詞：組蛋白去甲基化酶JMJD3在SAHF形成中的作用及機制研究

  更多相關(guān)文章： JMJD3 RB蛋白 SAHF 賴氨酸去甲基化 表觀遺傳修飾

【摘要】：細胞衰老是指細胞受到特定的刺激后進入不可逆的細胞周期停滯的狀態(tài)。癌基因的誘導(dǎo)或者復(fù)制性衰老都可以引起人二倍體成纖維細胞的細胞核內(nèi)染色質(zhì)重排,形成異染色質(zhì)凝集,這一現(xiàn)象被稱為衰老相關(guān)的異染色質(zhì)凝集(SAHF)。SAHF由細胞核內(nèi)的染色體重塑凝集形成致密的染色質(zhì)區(qū)域,每一條染色體形成一個凝集點,能夠被DAPI染料識別出來。SAHF凝集點包含與基因沉默相關(guān)的H3K9me3、HP1蛋白、HMGA1蛋白、PML、marcoH2A等,并且將E2F靶基因也包裹在凝集點中,抑制了E2F靶基因的表達。研究表明,SAHF的形成抑制了與細胞增殖相關(guān)的基因的表達,并且一些癌細胞也能夠被誘導(dǎo)形成SAHF,這對于開發(fā)新的抗癌藥物提供了新的思路。但是目前對于SAHF組裝和維持的具體過程了解的還不是很透徹。RB蛋白對于細胞生命活動至關(guān)重要,許多癌癥的發(fā)生都與RB蛋白的突變有關(guān)。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)在SAHF的形成過程中,RB蛋白也發(fā)揮著重要功能,一些RB蛋白突變或者不能夠被激活的細胞系是不能夠形成SAHF的。據(jù)報道,RB蛋白可以發(fā)生多種翻譯后修飾,如乙酰化、泛素化、磷酸化、甲基化等,這些翻譯后修飾可以調(diào)控RB蛋白的功能。如Ser807/811的磷酸化調(diào)控著許多細胞生命活動,并且RB蛋白的甲基化可以影響其磷酸化。但是RB蛋白究竟是怎樣影響SAHF的形成的,其甲基化是否也會影響SAHF的形成過程尚不清楚。JMJD3蛋白屬于JMJD家族的一個組蛋白去甲基化酶,這個家族的成員都包含有JmjC結(jié)構(gòu)域。JMJD3調(diào)控了許多生命活動,比如胚胎干細胞和神經(jīng)細胞的分化、巨噬細胞的炎癥反應(yīng)以及細胞衰老等,JMJD3的異常表達與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。文獻報道,在人和小鼠成纖維細胞中JMJD3能夠去除p16啟動子處和基因編碼區(qū)的H3K27me3,激活p16基因的表達。但是在我們前期的預(yù)實驗中我們發(fā)現(xiàn),在p16基因缺失的細胞系MDA-MB-231中,外源過表達JMJD3依然能夠誘導(dǎo)細胞衰老并且形成SAHF。因此我們推測在JMJD3誘導(dǎo)細胞衰老的過程中可能還存在一條不依賴p16的途徑。在本論文的研究中我們發(fā)現(xiàn),在WI38細胞中沉默JMJD3的表達會影響H-RasV12誘導(dǎo)的細胞衰老以及SAHF形成,JMJD3的表達對SAHF的形成是必需的。JMJD3在H-RasV12誘導(dǎo)的細胞衰老以及SAHF形成過程中表達上調(diào),在WI38細胞中過表達JMJD3可以誘導(dǎo)細胞形成SAHF,并且這一過程是需要其去甲基化酶活性的。免疫熒光實驗分析發(fā)現(xiàn)在SAHF形成過程中,JMJD3在細胞質(zhì)中的表達明顯上升,但是在細胞核中并沒有明顯的升高,蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗證實JMJD3能夠與RB蛋白相互作用,進一步研究發(fā)現(xiàn)JMJD3通過其JmjC結(jié)構(gòu)域與RB蛋白的659-840結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合。體外甲基化-去甲基化實驗發(fā)現(xiàn)JMJD3能夠催化Set7/9介導(dǎo)的RB蛋白的甲基化位點去甲基化,并且確定了去甲基化的位點是RB蛋白第810位賴氨酸,表明組蛋白去甲基化酶JMJD3也可以催化非組蛋白去甲基化。隨后我們檢測出JMJD3的過表達以及干涉會影響RB蛋白與CDK4的結(jié)合情況,實驗結(jié)果表明JMJD3催化RB去甲基化的作用抑制了CDK4與RB蛋白的結(jié)合,降低了RB蛋白S807/811的磷酸化水平,進而抑制了E2F靶基因的表達,促進細胞衰老形成SAHF。本論文的研究結(jié)果表明,JMJD3是一個新的SAHF的誘導(dǎo)因子,JMJD3可以通過催化非組蛋白RB蛋白K810位去甲基化,促進SAHF的形成。發(fā)現(xiàn)非組蛋白的翻譯后修飾參與細胞衰老和SAHF形成,為更好的了解SAHF形成的機制提供了重要的實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：JMJD3 RB蛋白 SAHF 賴氨酸去甲基化 表觀遺傳修飾
【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q343
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-11
• 第一部分 引言11-29
• 一、細胞衰老11-22
• （一）細胞衰老的特點及意義11-13
• （二）細胞衰老相關(guān)的異染色質(zhì)凝集13-16
• 1. SAHF簡介13-14
• 2. SAHF的形成過程14-16
• 3. SAHF形成中的表觀遺傳修飾16
• （三）與SAHF形成相關(guān)的信號通路16-18
• （四）細胞衰老的原因18-21
• （五）SAHF的形成與癌癥21-22
• 二、組蛋白去甲基化酶JMJD322-24
• （一）組蛋白去甲基化酶家族簡介22-23
• （二）組蛋白去甲基化酶JMJD3的功能簡介23-24
• 三、RB蛋白及其翻譯后修飾的功能及影響24-27
• （一）蛋白的翻譯后修飾24
• （二）RB蛋白介紹24-27
• 四、本論文研究的內(nèi)容及意義27-29
• （一）立題依據(jù)27
• （二）研究的內(nèi)容及意義27-29
• 第二部分 實驗材料及方法29-52
• 一、實驗材料29-31
• （一）蛋白質(zhì)與抗體29-30
• （二）哺乳動物細胞系30
• （三）試劑30-31
• 二、實驗方法31-52
• Ⅰ.分子生物學實驗方法31-41
• （一）質(zhì)粒構(gòu)建31
• （二）DNA瓊脂糖凝膠電泳31
• （三）質(zhì)粒大量制備方法31-32
• （四）哺乳動物細胞總RNA的提取方法及反轉(zhuǎn)錄PCR32-33
• （五）PCR及熒光實時定量PCR33-36
• （六）慢病毒干涉質(zhì)粒構(gòu)建36-37
• （七）Flag親和層析37
• （八）GST融合蛋白純化及GST Pull-down實驗37-39
• （九）體外甲基化-去甲基化實驗39-41
• Ⅱ.細胞生物學實驗方法41-50
• （一）哺乳動物細胞系的培養(yǎng)41
• （二）PEI轉(zhuǎn)染41
• （三）逆病毒包裝及感染41-42
• （四）慢病毒包裝及感染42-43
• （五）Western Blotting檢測43-45
• （六）DAPI染色實驗45-46
• （七）免疫熒光檢測46-47
• （八）衰老染色47
• （九）BrdU摻入47-48
• （十）細胞質(zhì)/細胞核蛋白質(zhì)抽提48-49
• （十一）蛋白質(zhì)免疫共沉淀49-50
• Ⅲ.統(tǒng)計分析50-52
• 第三部分 實驗結(jié)果與分析52-72
• 一、干涉JMJD3表達抑制SAHF的形成52-54
• （一）JMJD3在H-RasV12誘導(dǎo)WI38細胞形成SAHF過程中表達上調(diào)52
• （二）干涉JMJD3逆轉(zhuǎn)H-RasV12誘導(dǎo)WI38細胞衰老52-53
• （三）沉默JMJD3后H-RasV12誘導(dǎo)WI38細胞形成SAHF比率下降53-54
• 二、過表達JMJD3誘導(dǎo)SAHF形成54-57
• （一）外源過表達JMJD3誘導(dǎo)WI38細胞衰老54-55
• （二）外源過表達JMJD3誘導(dǎo)WI38細胞形成SAHF55-57
• 三、JMJD3與RB蛋白相互作用57-62
• （一）JMJD3在SAHF形成過程中在細胞質(zhì)中聚集57-58
• （二）JMJD3與RB蛋白相互結(jié)合58-59
• （三）JMJD3通過其JmjC結(jié)構(gòu)域與RB蛋白相互作用59-62
• 1. RB蛋白能結(jié)合到JMJD3蛋白的JmjC結(jié)構(gòu)域59-60
• 2. RB蛋白的 659-840結(jié)構(gòu)域與Jmj C直接結(jié)合60-62
• 四、JMJD3能夠?qū)B蛋白K810位去甲基化62-67
• （一）JMJD3能夠催化RB蛋白去甲基化62
• （二）JMJD3能夠催化Set7/9 介導(dǎo)的RB蛋白甲基化位點去甲基化62-65
• （三）JMJD3催化RB去甲基化的位點是第810位65-67
• 五、JMJD3催化RB去甲基化從而抑制RB蛋白的磷酸化67-72
• （一）JMJD3抑制RB蛋白的磷酸化67-69
• （二）JMJD3抑制RB與CDK4的結(jié)合69
• （三）RB的去甲基化抑制E2F靶基因的表達，進而促進SAHF的形成69-72
• 第四部分 討論72-77
• 一、SAHF形成中的表觀遺傳修飾72-74
• 二、JMJD3誘導(dǎo)細胞形成SAHF不依賴于p16途徑74-75
• 三、RB蛋白甲基化-去甲基化修飾與磷酸化修飾之間的crosstalk75
• 四、RB蛋白的去甲基化影響部分E2F靶基因的表達75-76
• 五、JMJD3誘導(dǎo)SAHF形成的機制76-77
• 主要結(jié)論和創(chuàng)新點77-78
• 一、主要結(jié)論77
• 二、主要創(chuàng)新點77-78
• 參考文獻78-93
• 附錄93-96
• 致謝96-97
• 在校期間公開發(fā)表論文情況97

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