發(fā)布時(shí)間：2017-09-18 10:32

  本文關(guān)鍵詞：MADS盒基因NtSVP調(diào)控?zé)煵莼ūl(fā)育的分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 花柄 MADS-box轉(zhuǎn)錄因子 煙草 轉(zhuǎn)錄抑制子 BP

【摘要】：花柄是開花植物上連接花與花序主莖的部分,在花發(fā)育、果實(shí)成熟等過(guò)程運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)成分,是解剖學(xué)上重要的器官。同時(shí),作物花柄的長(zhǎng)短及其與主莖的夾角直接影響花序和穗的發(fā)育和形態(tài),是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一。有關(guān)花柄發(fā)育的研究主要集中在模式植物擬南芥中。目前已鑒定與花柄發(fā)育相關(guān)的基因包括BREVIPEDICELLUS(BP), ERECTA{ER), CRM1/BIG等轉(zhuǎn)錄因子。但是有關(guān)其它植物花柄發(fā)育的工作還鮮有報(bào)道。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),煙草MADS-box基因NtSVP是煙草花柄發(fā)育所必需的,在調(diào)控花柄延伸方面發(fā)揮重要作用。我們進(jìn)而對(duì)NtSVP進(jìn)行功能分析,并研究它調(diào)控花柄發(fā)育的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下：1.與野生型相比,RNA干擾(RNAi)下調(diào)NtSVP基因使煙草花柄顯著增長(zhǎng),花序結(jié)構(gòu)舒展；而過(guò)表達(dá)NtSVP導(dǎo)致花序緊湊,花柄長(zhǎng)度嚴(yán)重縮短,幾乎消失。石蠟切片觀察表明,花柄長(zhǎng)度的改變是由花柄細(xì)胞延伸的變異造成的,與細(xì)胞的分裂無(wú)關(guān)。2.鑒于擬南芥中Ⅰ類KNOX家族的轉(zhuǎn)錄因子BP是控制花柄發(fā)育的重要因子之一,我們利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了煙草的一個(gè)最近的同源基因\NtBPL在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)NtSVP使NtBPL的表達(dá)量升高。過(guò)表達(dá)NtBPL使花柄長(zhǎng)度增加：而下調(diào)NtBPL花柄縮短。NtBPL-RNAi轉(zhuǎn)基因植株中NtSVP表達(dá)未發(fā)生變化,顯微觀察發(fā)現(xiàn)其花柄長(zhǎng)度的改變是由花柄細(xì)胞變短引起的。3.為了進(jìn)一步確定NtSVP和NtBPL的調(diào)控關(guān)系,我們通過(guò)雜交獲得了NtBPLNtBPL-RNAi x NtSVP-RNAi雜交植株,發(fā)現(xiàn)其花柄縮短,長(zhǎng)度接近于NtBPL-KNAi植株花柄,表明兩者調(diào)控?zé)煵莼ū由斓耐凡糠种丿B,且NtSVP位于NtBPL上游。4.為了解NtSVP是否直接調(diào)控NtBPL表達(dá),我們進(jìn)行了酵母單雜交和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,NtSVP蛋白可以直接結(jié)合到NtBPL啟動(dòng)子上的CArG-box [C(A/T)8G]元件,說(shuō)明NtBPL是NtSVP直接的下游靶基因。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性分析表明NtSVP是個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子,這與NtBPL在NtSVP-OE轉(zhuǎn)基因煙草花柄中表達(dá)量顯著下降的現(xiàn)象是一致的。5.為了了解NtBPL是通過(guò)怎樣的路徑實(shí)現(xiàn)對(duì)花柄長(zhǎng)度的調(diào)控,我們利用安捷倫煙草芯片,比較了NtBPL下調(diào)后基因的變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有7個(gè)赤霉素(GA)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著地變化,包括5個(gè)GA合成基因,CPS, KS, KAO, GA3oxl, GA3ox2。它們的表達(dá)均被下調(diào),暗示NtBPL可能通過(guò)GA,尤其是調(diào)控GA的合成來(lái)影響花柄細(xì)胞的延伸,從而調(diào)控花柄的長(zhǎng)度。綜上所述,我們的工作發(fā)現(xiàn)了調(diào)控一個(gè)花柄發(fā)育的新機(jī)制,即NtSVP通過(guò)直接調(diào)控NtBPL,并進(jìn)而影響GA的合成,達(dá)到調(diào)控花柄延伸目的。本工作在擬南芥已知功能基因NtBPL上游,確定了一個(gè)MADS-box基因參與花柄發(fā)育功能和調(diào)控路徑,拓展了我們對(duì)植物花柄發(fā)育知識(shí),對(duì)通過(guò)改良花柄長(zhǎng)度和夾角來(lái)改變植物花序和穗型,提高作物產(chǎn)量,具有一定的借鑒意義。
【關(guān)鍵詞】：花柄 MADS-box轉(zhuǎn)錄因子 煙草 轉(zhuǎn)錄抑制子 BP
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 博士學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)簽名表4-5
• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-28
• 1.1 MADS-box基因研究進(jìn)展13-17
• 1.1.1 MADS-box基因簡(jiǎn)介13-14
• 1.1.2 調(diào)控花器官發(fā)育的ABCE模型14-16
• 1.1.3 MADS-box基因與開花時(shí)間16-17
• 1.2 KNOX家族17-22
• 1.2.1 TALE家族17-18
• 1.2.2 Ⅰ類KNOX基因功能介紹18-20
• 1.2.3 KNOX-BELL間的蛋白互作20-21
• 1.2.4 Ⅰ類KNOX基因功能與激素的聯(lián)系21-22
• 1.3 GA的生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)22-24
• 1.3.1 GA的生物合成22-23
• 1.3.2 DELLA蛋白23-24
• 1.3.3 GA對(duì)細(xì)胞分裂和延伸的影響24
• 1.4 花柄的發(fā)育研究24-26
• 1.4.1 ERECTA調(diào)節(jié)花柄發(fā)育的模式24-25
• 1.4.2 BP/KNAT1調(diào)節(jié)花柄發(fā)育的模式25-26
• 1.4.3 其他影響花柄發(fā)育的基因26
• 1.5 本研究意義內(nèi)容及技術(shù)路線26-28
• 1.5.1 研究?jī)?nèi)容和意義26-27
• 1.5.2 研究的技術(shù)路線27-28
• 第二章 NtSVP對(duì)煙草花柄發(fā)育的影響28-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 2.1.1 植物材料28
• 2.1.2 酶及其它實(shí)驗(yàn)耗材28
• 2.1.3 菌株與載體28
• 2.1.4 引物28-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 2.2.1 煙草的種植29
• 2.2.2 煙草基因組DNA的提取29
• 2.2.3 煙草總RNA提取29-30
• 2.2.4 RT-PCR30
• 2.2.5 反轉(zhuǎn)錄效率檢測(cè)30-31
• 2.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR31
• 2.2.7 石蠟切片制備31-32
• 2.2.8 表型觀察和組織細(xì)胞學(xué)分析32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-39
• 2.3.1 NtSVP的序列分析32-34
• 2.3.2 NtSVP的組織特異性表達(dá)34-35
• 2.3.3 NtSVP轉(zhuǎn)基因煙草的表型35-36
• 2.3.4 NtSVP對(duì)煙草花柄發(fā)育的影響36-37
• 2.3.5 NtSVP轉(zhuǎn)基因煙草花柄的組織細(xì)胞學(xué)分析37-39
• 2.4 討論39-40
• 第三章 NtBPL控制煙草花柄的延伸40-57
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 3.1.1 植物材料40
• 3.1.2 酶及其它實(shí)驗(yàn)耗材40
• 3.1.3 菌株與載體40
• 3.1.4 引物40-41
• 3.1.5 植物組培所需培養(yǎng)基和激素母液的配制41
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法41-48
• 3.2.1 目標(biāo)基因的克隆41-43
• 3.2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化43-44
• 3.2.3 構(gòu)建NtBPL過(guò)表達(dá)載體44-45
• 3.2.4 構(gòu)建NtBPL-RNAi載體45-46
• 3.2.5 煙草轉(zhuǎn)化46-47
• 3.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定47-48
• 3.3 結(jié)果分析48-56
• 3.3.1 NtBPL在NtSVP轉(zhuǎn)基因煙草花柄中表達(dá)量檢測(cè)48-49
• 3.3.2 NtBPL的序列分析49-51
• 3.3.3 NtBPL的時(shí)空表達(dá)分析51-52
• 3.3.4 NtBPL轉(zhuǎn)基因煙草植株鑒定52-53
• 3.3.5 NtBPL轉(zhuǎn)基因煙草表型觀察與分析53-54
• 3.3.6 NtBPL對(duì)煙草花柄延伸的影響54
• 3.3.7 NtBPL轉(zhuǎn)基因煙草花柄的組織細(xì)胞學(xué)分析54-56
• 3.4 討論56-57
• 第四章 煙草花柄發(fā)育過(guò)程中NtSVP對(duì)NtBPL的調(diào)控57-73
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料57-58
• 4.1.1 植物材料57
• 4.1.2 試劑及其它實(shí)驗(yàn)耗材57
• 4.1.3 菌株與載體57
• 4.1.4 引物57
• 4.1.5 各種試劑和培養(yǎng)基的配制57-58
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法58-67
• 4.2.1 轉(zhuǎn)基因煙草的雜交58
• 4.2.2 NtBPL啟動(dòng)子的克隆58-60
• 4.2.3 酵母單雜交60-62
• 4.2.4 NtSVP-MBP融合蛋白的表達(dá)62-63
• 4.2.5 凝膠阻滯63-65
• 4.2.6 轉(zhuǎn)錄活性分析65-67
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-72
• 4.3.1 雜交煙草的花柄表型67-68
• 4.3.2 NtBPL啟動(dòng)子的克隆68
• 4.3.3 酵母單雜交68-69
• 4.3.4 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)69-70
• 4.3.5 通過(guò)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)分析NtSVP的轉(zhuǎn)錄活性70-72
• 4.4 討論72-73
• 第五章 煙草基因芯片分析NtBPL的下游基因73-80
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料73
• 5.1.1 植物材料73
• 5.1.2 試劑與耗材73
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法73-74
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)流程73
• 5.2.2 差異基因的篩選73
• 5.2.3 差異基因的注釋和分析73-74
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析74-79
• 5.3.1 差異基因的qRT-PCR檢測(cè)74
• 5.3.2 GO功能富集分析74-76
• 5.3.3 差異基因MapMan分析76-77
• 5.3.4 NtSVP-NtBPL可以通過(guò)影響GA來(lái)調(diào)控花柄延伸77-78
• 5.3.5 CK不參與NtSVP-NtBPL對(duì)花柄延伸的調(diào)控78-79
• 5.4 討論79-80
• 第六章 全文結(jié)論80-81
• 參考文獻(xiàn)81-93
• 致謝93-94
• 作者簡(jiǎn)歷94

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 崔永蘭,張露,黃敏仁;植物MADS盒基因研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物工程雜志;2003年09期

2 袁自強(qiáng),錢曉茵,劉軍,劉建東,錢e，

本文編號(hào)：874993