本文關(guān)鍵詞：基于等溫酶循環(huán)放大技術(shù)的DNA生物傳感分析及應(yīng)用研究

  更多相關(guān)文章： 循環(huán)放大 DNA 傳感器 石英晶體微天平 熒光光譜 核酸適體

【摘要】：本文采用石英晶體微天平及熒光光譜分析檢測方法,基于核酸適體與目標分子的高親和力以及特異性識別作用,結(jié)合納米金生物條碼技術(shù)及核酸聚合酶、內(nèi)切酶等工具酶的自身特性,構(gòu)建了基于酶循環(huán)信號放大方法、DNA自組裝信號放大方法、滾環(huán)復(fù)制與自組裝循環(huán)放大相結(jié)合、等溫鏈置換放大方法以及滾環(huán)復(fù)制放大方法,實現(xiàn)了生物小分子、基因及DNA甲基化酶等腫瘤標志物的高靈敏及高選擇性檢測。主要內(nèi)容如下:1、構(gòu)建了新型的石英晶體微天平傳感器,結(jié)合DNA酶循環(huán)放大方法實現(xiàn)了對ATP的高靈敏檢測。將適體的特異性識別作用與DNA酶循環(huán)放大相結(jié)合,以納米金生物條碼作為信號探針,通過鏈替代聚合反應(yīng),將信號探針與修飾在芯片表面的捕獲探針相結(jié)合,使檢測信號顯著增強,以生物小分子ATP為靶分子,檢測限達1.3 n M。利用核酸適體的特異性識別特點,提高了檢測的選擇性,并將該方法用于腫瘤細胞(Ramos)中ATP含量的測定,進一步驗證了檢測系統(tǒng)的實用性。該方法靈敏度高,選擇性好,適用于復(fù)雜生物樣品中ATP的選擇性分析,為生物學(xué)研究、基于檢測以及腫瘤的早期診斷提供了有效的分析手段。2、提出了自組裝雜交鏈式反應(yīng)放大的石英晶體微天平檢測DNA的新方法。將自組裝雜交鏈式反應(yīng)與生物催化沉淀技術(shù)相結(jié)合,增大了芯片表面的質(zhì)量,提高了檢測靈敏度。通過芯片結(jié)合的靶DNA引發(fā)雜交鏈式反應(yīng),進一步進行生物催化沉淀,從而將少量的靶DNA轉(zhuǎn)化成大量的沉淀物,放大檢測信號,采用石英晶體微天平技術(shù)實現(xiàn)了靶DNA的高靈敏檢測,檢測限達5×10-11M。檢測系統(tǒng)采用捕獲探針修飾芯片,提高了系統(tǒng)的選擇性,減小了非特異性吸附,有望用于單核苷酸多態(tài)性方面的研究。3、基于等溫循環(huán)鏈置換聚合擴增技術(shù),設(shè)計了ATP高靈敏檢測的熒光傳感系統(tǒng)。通過靶分子與適體的特異性識別作用引發(fā)鏈置換聚合反應(yīng),在DNA酶的作用下,一個鏈置換聚合反應(yīng)的產(chǎn)物作為另一個反應(yīng)的催化鏈,形成了DNA循環(huán)放大網(wǎng)絡(luò),提高了反應(yīng)的放大效率,以ATP為目標分析物,熒光探針為檢測信號,實現(xiàn)了ATP的快速、靈敏檢測,檢測限達2.6×10-10 M。成功應(yīng)用于人血清實際樣品中ATP的分析。該方法適用范圍廣、選擇性強、操作便捷,在生物檢測方面具有潛在的應(yīng)用價值。4、構(gòu)建了一種新型DNA級聯(lián)循環(huán)放大分子機器,并將其成功應(yīng)用于DNA的高靈敏檢測。通過靶DNA的雜交互補反應(yīng)引發(fā)模板增強雜交過程(TEHP),在DNA工具酶的作用下發(fā)生滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)(RCA),生成大量的具有重復(fù)序列的產(chǎn)物,在剪切酶作用下RCA產(chǎn)物引發(fā)發(fā)卡催化自組裝循環(huán)反應(yīng)(CHA),同時將模板鏈與靶釋放出來形成源頭循環(huán)。通過DNA級聯(lián)循環(huán)放大,釋放大量的熒光探針,極大地增強了熒光檢測信號,從而實現(xiàn)了對DNA的高靈敏檢測。DNA的檢測限為1.2×10-18 M,系統(tǒng)中引入模板增強雜交過程,提高了靶DNA的選擇性,為基因檢測提供了有效的分析手段。5、提出了一種基于滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)熒光檢測DNA甲基化酶的新方法。通過DNA甲基化反應(yīng)生成DNA短鏈,該鏈作為RCA的前體與環(huán)狀模板結(jié)合,在聚合酶作用下發(fā)生滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng),將熒光信號探針與帶有大量重復(fù)序列的滾環(huán)復(fù)制的長鏈相結(jié)合,使檢測信號顯著增強,對DNA甲基化酶的檢測限可達0.6 U/m L。運用該方法對抗癌藥物的抑制效果進行研究,有望用于抗癌藥物的篩選,通過檢測DNA甲基化水平的變化在癌癥早期風(fēng)險評估及分子診斷治療方面具有潛在應(yīng)用價值。
【關(guān)鍵詞】：循環(huán)放大 DNA 傳感器 石英晶體微天平 熒光光譜 核酸適體
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q789
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-12
• 第一章 前言12-64
• 1.1 DNA生物傳感器13-27
• 1.1.1 核酸14-18
• 1.1.2 DNA傳感器的檢測方法18-27
• 1.2 石英晶體微天平27-45
• 1.2.1 石英晶體微天平原理27-31
• 1.2.2 石英晶體微天平的構(gòu)成及特點31-33
• 1.2.3 QCM生物傳感器在生化分析中的應(yīng)用33-45
• 1.3 熒光光譜檢測技術(shù)45-56
• 1.3.1 熒光產(chǎn)生機理45-46
• 1.3.2 DNA熒光探針及其在生化分析中的應(yīng)用研究46-56
• 1.4 等溫循環(huán)放大技術(shù)及DNA傳感分析的研究進展56-63
• 1.4.1 滾環(huán)復(fù)制放大56-58
• 1.4.2 鏈替代聚合放大58-59
• 1.4.3 核酸內(nèi)切酶循環(huán)放大59-61
• 1.4.4 核酸外切酶循環(huán)放大61-63
• 1.5 本課題的意義和研究內(nèi)容63-64
• 第二章 基于酶循環(huán)信號放大技術(shù)QCM檢測ATP研究64-88
• 2.1 實驗部分65-70
• 2.1.1 試劑65-67
• 2.1.2 儀器67
• 2.1.3 納米金的制備67
• 2.1.4 納米金生物條碼的制備67-68
• 2.1.5 DNA標記磁性微球68
• 2.1.6 納米金磁性微球復(fù)合物的制備68
• 2.1.7 芯片的清洗及修飾68
• 2.1.8 細胞內(nèi)ATP的提取68-69
• 2.1.9 等溫鏈替代循環(huán)放大反應(yīng)69
• 2.1.10石英晶體微天平檢測69
• 2.1.11高效液相色譜法（HPLC）檢測ATP69-70
• 2.1.12聚丙烯酰胺凝膠電泳70
• 2.2 結(jié)果與討論70-86
• 2.2.1 基于等溫酶循環(huán)放大技術(shù)的石英晶體微天平檢測原理70-71
• 2.2.2 金納米粒子的表征71-72
• 2.2.3 納米金生物條碼的紫外光譜表征72-73
• 2.2.4 可行性研究73-76
• 2.2.5 非特異性吸附研究76-77
• 2.2.6 實驗條件的優(yōu)化77-82
• 2.2.7 酶循環(huán)信號放大QCM檢測ATP的靈敏度82-85
• 2.2.8 酶循環(huán)信號放大QCM檢測ATP的選擇性85-86
• 2.2.9 癌細胞內(nèi)ATP的檢測86
• 2.3 小結(jié)86-88
• 第三章 基于自組裝信號放大技術(shù)QCM檢測DNA的研究88-97
• 3.1 實驗部分89-90
• 3.1.1 試劑89
• 3.1.2 儀器89-90
• 3.1.3 芯片修飾90
• 3.1.4 石英晶體微天平檢測90
• 3.2 結(jié)果與討論90-96
• 3.2.1 基于自組裝信號放大技術(shù)的石英晶體微天平檢測DNA原理90-91
• 3.2.2 可行性研究91-92
• 3.2.3 實驗條件的優(yōu)化92-93
• 3.2.4 自組裝信號放大QCM檢測DNA的靈敏度93-95
• 3.2.5 自組裝放大QCM檢測DNA的選擇性95-96
• 3.3 小結(jié)96-97
• 第四章 基于等溫循環(huán)鏈置換放大熒光檢測ATP的研究97-112
• 4.1 實驗部分98-100
• 4.1.1 試劑98-99
• 4.1.2 儀器99
• 4.1.3 DNA標記磁性微球99-100
• 4.1.4 等溫循環(huán)鏈置換聚合放大反應(yīng)100
• 4.1.5 熒光光譜檢測100
• 4.2 結(jié)果與討論100-111
• 4.2.1 基于等溫循環(huán)鏈置換聚合放大反應(yīng)檢測ATP原理100-101
• 4.2.2 DNA標記磁珠的紫外光譜表征101-102
• 4.2.3 可行性研究102-103
• 4.2.4 實驗條件的優(yōu)化103-106
• 4.2.5 熒光檢測ATP的靈敏度檢測106-110
• 4.2.6 ATP的選擇性檢測110-111
• 4.2.7 實際樣品中ATP的檢測111
• 4.3 小結(jié)111-112
• 第五章 基于滾環(huán)復(fù)制與自組裝循環(huán)放大熒光檢測DNA的研究112-130
• 5.1 實驗部分113-115
• 5.1.1 試劑113-114
• 5.1.2 儀器114
• 5.1.3 DNA級聯(lián)循環(huán)放大反應(yīng)114-115
• 5.1.4 熒光光譜檢測115
• 5.2 結(jié)果與討論115-128
• 5.2.1 基于DNA級聯(lián)循環(huán)放大反應(yīng)檢測原理115-116
• 5.2.2 可行性研究116-118
• 5.2.3 信號放大性能的研究118-119
• 5.2.4 實驗條件的優(yōu)化119-122
• 5.2.5 基于級聯(lián)信號放大熒光檢測DNA的靈敏度122-127
• 5.2.6 DNA檢測的選擇性127-128
• 5.3 小結(jié)128-130
• 第六章 基于滾環(huán)復(fù)制信號放大熒光檢測DNA甲基化的研究130-142
• 6.1 實驗部分131-133
• 6.1.1 試劑131-132
• 6.1.2 儀器132
• 6.1.3 環(huán)狀DNA的制備132
• 6.1.4 滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)檢測甲基化酶132-133
• 6.1.5 熒光光譜檢測133
• 6.2 結(jié)果與討論133-140
• 6.2.1 基于滾環(huán)復(fù)制信號放大反應(yīng)檢測原理133-134
• 6.2.2 可行性研究134-135
• 6.2.3 實驗條件的優(yōu)化135-137
• 6.2.4 基于滾環(huán)復(fù)制信號放大熒光檢測DNA甲基化酶的靈敏度137-138
• 6.2.5 藥物對DNA甲基化酶的活性研究138-140
• 6.2.6 DNA甲基化酶的選擇性研究140
• 6.3 小結(jié)140-142
• 參考文獻142-171
• 結(jié)論171-173
• 致謝173-174
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文174-176

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本文編號：807224