本文關鍵詞：達摩鳳蝶細胞系的建立與蛋白表達特性研究

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【摘要】：昆蟲細胞培養(yǎng)技術是近年來迅速發(fā)展起來的細胞工程中的主要領域之一,廣泛應用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)及生物學的各個方面。特別是昆蟲細胞桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(Baculovirus Expression Victor System,BEVS)被廣泛用于重組蛋白表達、工程疫苗和蛋白組學等領域,擁有巨大的開發(fā)潛力和應用前景。本文以鱗翅目(Lepidoptera)鳳蝶科(Papilionidae)的達摩鳳蝶Papilio demoleus Linnaeus新孵幼蟲為試驗材料,建立了4個達摩鳳蝶細胞系,并對其原代及傳代培養(yǎng)方法、基礎生物學特性、凍存與復蘇特性、病毒敏感性,以及對外源蛋白表達水平等方面進行了較詳盡的研究。新昆蟲細胞系的建立不但為離體條件下進行相關的昆蟲生理生化、桿狀病毒感染等研究提供實驗材料,也為昆蟲細胞系的建立研究、昆蟲細胞工程研究奠定了一定的科學基礎。主要的研究結(jié)果如下:1、達摩鳳蝶新孵幼蟲細胞系的建立使用改良的Grace培養(yǎng)基并輔以20%胎牛血清對達摩鳳蝶新孵幼蟲組織進行體外培養(yǎng)。經(jīng)過2年多的培養(yǎng),最終有4瓶培養(yǎng)物傳代超過50次且生物學特性穩(wěn)定、生長一直良好,成為可穩(wěn)定傳代的達摩鳳蝶新孵幼蟲細胞系,分別命名為RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2、RIRI-Pa De-3,以及RIRI-Pa De-4。2、達摩鳳蝶新孵幼蟲細胞系的基礎生物學特性(1)細胞系來源的分子鑒定:通過比對4個達摩鳳蝶細胞系和蟲卵的細胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)序列,結(jié)果顯示來源于4株細胞系和蟲卵的COI序列相似度為100%,證明4個新建細胞系來源于達摩鳳蝶組織。(2)細胞形態(tài)學特征:4個達摩鳳蝶細胞系均為貼壁生長型細胞,培養(yǎng)初期細胞種類多樣,進入穩(wěn)定傳代期后,各細胞系的細胞形態(tài)組成出現(xiàn)一定差異。RIRI-Pa De-1細胞形態(tài)主要為圓形、梭形和多邊形,其中圓形細胞占61.73±1.33%,直徑從7.06μm至35.112μm不等,懸浮狀態(tài)下細胞群體的平均直徑為6.79±0.27μm。RIRI-Pa De-2細胞形態(tài)主要為圓形,直徑從7.14μm至27.66μm不等,平均直徑為13.920±0.025μm,懸浮狀態(tài)下細胞群體的平均直徑為6.87±0.27μm。RIRI-Pa De-3細胞形態(tài)主要為類似表皮細胞和纖維狀細胞,懸浮狀態(tài)下細胞群體的平均直徑為6.66±0.56μm。RIRI-Pa De-4細胞形態(tài)主要為圓形、梭形和多邊形,其中圓形細胞占58.35±4.22%,直徑平均為13.813±0.421μm,懸浮狀態(tài)下細胞群體的平均直徑為6.71±0.47μm。(3)細胞增殖動力學特性:通過試驗繪制了4個細胞系的生長曲線,計算各個細胞系的群體倍增時間分別為:RIRI-Pa De-1是69.77h,RIRI-Pa De-2是67.42h,RIRI-Pa De-3是81.48h,RIRI-Pa De-4是65.43h,其中,RIRI-Pa De-4細胞增殖一倍所需時間最短,RIRIPa De-3細胞系的倍增時間最長。(4)核型分析:經(jīng)過試驗比較發(fā)現(xiàn),制片時使用的KCl低滲溶液最適濃度為0.60%。在1000倍光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),4個達摩鳳蝶新孵幼蟲細胞系的染色體呈點狀聚集于核區(qū),雖然數(shù)量眾多,但統(tǒng)計結(jié)果呈正態(tài)分布。細胞系RIRI-Pa De-1(61代)的染色體數(shù)目分布區(qū)間為36~90,平均為63條;RIRI-Pa De-2(60代)的染色體數(shù)目分布區(qū)間為49~97,平均為73條;RIRI-Pa De-3(52代)的染色體數(shù)目分布區(qū)間為46~90,平均為68條;RIRI-Pa De-4(52代)的染色體數(shù)目分布區(qū)間為45~91,平均為68條。(5)凍存與復蘇特性:通過對4個達摩鳳蝶細胞系進行長期液氮深低溫冷凍保存,分析凍存時間長短對細胞活力的影響,結(jié)果顯示4個細胞系經(jīng)過長期凍后活力均呈下降趨勢。但復蘇培養(yǎng)后能在短期(10d)內(nèi)恢復活力,且生長特性不變,說明使用常規(guī)凍存操作方法能夠?qū)崿F(xiàn)達摩鳳蝶細胞系在液氮中的長期保存與復蘇。3、達摩鳳蝶細胞系對6種昆蟲桿狀病毒的敏感性使用6種常見鱗翅目昆蟲桿狀病毒(苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Ac MNPV、家蠶核型多角體病毒Bm NPV、春尺蠖核型多角體病毒Aci NPV、美國白蛾核型多角體病毒Hycu NPV、舞毒蛾核型多角體病毒Ld NPV,以及柞蠶核型多角體病毒Anpe NPV)對4個達摩鳳蝶細胞系進行侵染測試,觀察4個達摩鳳蝶細胞系對病毒的反應,確定能夠侵染達摩鳳蝶細胞系的病毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ac MNPV能感染4個達摩鳳蝶細胞系;Aci NPV和Hycu NPV均可感染RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2、RIRI-Pa De-4,不能感染RIRI-Pa De-3;其余3株病毒均不能感染達摩鳳蝶細胞系。表明,4個達摩鳳蝶細胞系都對Ac MNPV敏感,RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2,以及RIRI-Pa De-4細胞系對Aci NPV和Hycu NPV敏感;4個達摩鳳蝶細胞系對Bm NPV、Ld NPV,以及Anpe NPV均不敏感。4、對3種報告基因表達水平的研究為了研究4個達摩鳳蝶細胞系對重組外源基因的表達特性,本論文利用Bac-to-Bac#174;桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建了3株攜帶不同報告基因的重組桿狀病毒,分別為重組綠色熒光蛋白桿狀病毒Ac MNPV-GFP、重組β-半乳糖苷酶桿狀病毒Ac MNPV-Lac Z,以及重組分泌型堿性磷酸酶桿狀病毒Ac MNPV-SEAP。通過感染達摩鳳蝶細胞系和作為對照的Sf9和High Five細胞系,檢測和比較重組蛋白在各細胞系中的表達水平。(1)達摩鳳蝶細胞系對Ac MNPV-GFP敏感性:使用有限稀釋法,測定達摩鳳蝶細胞系、Sf9,以及High Five對Ac MNPV-GFP的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Median Tissue Culture Infectious Dose,TCID50),獲得結(jié)果為:RIRI-Pa De-2和RIRI-Pa De-4表達的綠色熒光蛋白量及其微弱,鏡檢無法觀測到;High Five的TCID50最小(10-6.88),說明對Ac MNPV-GFP最敏感,其次是RIRI-Pa De-1(TCID50=10-6.55),之后為Sf9(TCID50=10-6.5),對Ac MNPVGFP敏感度最低的是RIRI-Pa De-3(TCID50=10-5.45)。(2)重組綠色熒光蛋白在達摩鳳蝶細胞系中的表達水平:Sf9對重組綠色熒光蛋白的表達量最高。雖然細胞系RIRI-Pa De-1對Ac MNP-GFP敏感性比Sf9高,但重組綠色熒光蛋白的表達水平僅為Sf9的1/10,RIRI-Pa De-3的表達水平為Sf9的1/18,RIRI-Pa De-2和RIRI-Pa De-4的表達水平為Sf9的1/27,High Five表達重組綠色熒光蛋白的水平為Sf9的一半。(3)重組β-半乳糖苷酶在達摩鳳蝶細胞系中的表達水平:重組β-半乳糖苷酶在4個達摩鳳蝶細胞系中的表達水平均很低。接種Ac MNPV-Lac Z病毒48h后Sf9和High Five便開始顯著表達重組β-半乳糖苷酶,此時4個達摩鳳蝶細胞系中重組β-半乳糖苷酶活性非常低。96h后RIRI-Pa De-3細胞中檢測到重組β-半乳糖苷酶活性升高,但僅為Sf9中β-半乳糖苷酶活性的1/11。216h后重組β-半乳糖苷酶在6個細胞中的表達量達到最大,High Five最高,其次為Sf9,RIRI-Pa De-3僅為High Five的1/8,RIRI-Pa De-4表達量排第4,約為High Five表達水平的1/18,RIRI-Pa De-2約為High Five的1/24,RIRI-Pa De-1表達水平最低。(4)重組分析型堿性磷酸酶在達摩鳳蝶細胞系中的表達水平:重組SEAP在4個達摩鳳蝶細胞系中的表達水平與Sf9和High Five的相當甚至更高。接種Ac MNPV-SEAP病毒48h后6個細胞系均顯著表達重組SEAP。144h時RIRI-Pa De-1和RIRI-Pa De-2的表達量達增加最快。169h后各細胞系均達到表達最高峰,相互之間表達量相差不大。216h后各除RIRI-Pa De-3外,其他5個細胞系表達重組SEAP的水平均開始下降。到240h時,RIRI-Pa De-3仍保持較高的重組SEAP表達水平。結(jié)果表明,4個達摩鳳蝶細胞系對重組SEAP的表達水平與Sf9和High Five相當,其中RIRI-Pa De-3細胞系對重組SEAP的表達水平顯著高于Sf9和High Five,有開發(fā)和利用其作為桿狀病毒表達系統(tǒng)宿主細胞系的潛力。綜上所述,本文以達摩鳳蝶新孵幼蟲為試驗材料建立了4個達摩鳳蝶細胞系,其基礎生物學特性、病毒敏感性,以及對外源蛋白表達水平等方面均有差異:4個達摩鳳蝶細胞系均對Ac MNPV敏感,3個細胞系(RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2,以及RIRI-Pa De-4)對Aci NPV和Hycu NPV敏感;4個達摩鳳蝶細胞系對重組綠色熒光蛋白和β-半乳糖苷酶的表達水平均較低,但對重組分泌型堿性磷酸酶的表達水平高于Sf9和High Five,具有進一步研究的價值。
【關鍵詞】：達摩鳳蝶 昆蟲細胞系 桿狀病毒 報告基因 表達水平
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;Q813
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-20
• 第一章 緒論20-32
• 1.1 引言20-21
• 1.1.1 研究背景20
• 1.1.2 研究目的和意義20-21
• 1.1.3 項目來源與經(jīng)費支持21
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與評述21-29
• 1.2.1 昆蟲細胞培養(yǎng)的一般概況21-22
• 1.2.2 昆蟲細胞的研究、應用現(xiàn)狀以及發(fā)展趨勢22-29
• 1.3 研究目標和主要研究內(nèi)容29-31
• 1.3.1 研究目標29-30
• 1.3.2 研究的主要內(nèi)容30-31
• 1.4 研究技術路線31-32
• 第二章 達摩鳳蝶細胞系的建立及生物學特性研究32-57
• 2.1 試驗材料與方法32-40
• 2.1.1 試驗材料32-34
• 2.1.2 試驗方法34-40
• 2.2 結(jié)果與分析40-55
• 2.2.1 達摩鳳蝶新孵幼蟲細胞系的建立40-44
• 2.2.2 達摩鳳蝶新孵幼蟲細胞系的生物學特性44-53
• 2.2.3 達摩鳳蝶細胞系的凍存與復蘇53-55
• 2.3 小結(jié)55-57
• 第三章 達摩鳳蝶細胞系的病毒敏感性研究57-67
• 3.1 試驗材料與方法57-59
• 3.1.1 試驗材料57-59
• 3.1.2 試驗方法59
• 3.2 結(jié)果與分析59-66
• 3.2.1 RIRI-PaDe-1 細胞系對6種昆蟲桿狀病毒的敏感性59-60
• 3.2.2 RIRI-PaDe-2 細胞系對6種昆蟲桿狀病毒的敏感性60
• 3.2.3 RIRI-PaDe-3 細胞系對6種昆蟲桿狀病毒的敏感性60-65
• 3.2.4 RIRI-PaDe-4 細胞系對6種昆蟲桿狀病毒的敏感性65-66
• 3.3 小結(jié)66-67
• 第四章 重組綠色熒光蛋白在達摩鳳蝶細胞系中的表達67-81
• 4.1 試驗材料與方法67-76
• 4.1.1 試驗材料67-70
• 4.1.2 試驗方法70-76
• 4.2 結(jié)果與分析76-80
• 4.2.1 重組綠色熒光蛋白桿狀病毒(AcMNPV-GFP)的構(gòu)建結(jié)果76-78
• 4.2.2 達摩鳳蝶細胞系對AcMNPV-GFP的敏感性78-79
• 4.2.3 重組GFP在達摩鳳蝶細胞系中表達量的測定79-80
• 4.3 小結(jié)80-81
• 4.3.1 達摩鳳蝶細胞系對AcMNPV-GFP的敏感性80
• 4.3.2 重組GFP在達摩鳳蝶細胞系中的表達水平80-81
• 第五章 重組 β-半乳糖苷酶在達摩鳳蝶細胞系中的表達81-93
• 5.1 試驗材料與方法81-87
• 5.1.1 試驗材料81-83
• 5.1.2 試驗方法83-87
• 5.2 結(jié)果與分析87-92
• 5.2.1 重組 β-半乳糖苷酶桿狀病毒(AcMNPV-LacZ)的構(gòu)建結(jié)果87-88
• 5.2.2 重組 β-半乳糖苷酶在達摩鳳蝶細胞系中表達量的測定88-92
• 5.3 小結(jié)92-93
• 第六章 重組分泌型堿性磷酸酶在達摩鳳蝶細胞系的表達93-104
• 6.1 試驗材料與方法93-99
• 6.1.1 試驗材料93-95
• 6.1.2 試驗方法95-99
• 6.2 結(jié)果與分析99-103
• 6.2.1 重組分泌型堿性磷酸酶桿狀病毒(AcMNPV-SEAP)的構(gòu)建結(jié)果99-100
• 6.2.2 重組分泌型堿性磷酸酶在達摩鳳蝶細胞系中的表達的水平測定100-103
• 6.3 小結(jié)103-104
• 第七章 結(jié)論與討論104-116
• 7.1 結(jié)論104-107
• 7.2 創(chuàng)新點107
• 7.3 討論107-114
• 7.4 展望114-116
• 參考文獻116-129
• 在讀期間的學術研究129-130
• 致謝130

【參考文獻】

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1 張塏;余冰菲;陳瑞川;劉潤忠;;熒光定量檢測細胞綠色熒光蛋白技術的建立與應用[J];廈門大學學報(自然科學版);2008年S2期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 鄭桂玲;鱗翅目昆蟲胚胎細胞系的建立和高蛋白表達細胞克隆株的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2010年

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本文編號：806991