本文關(guān)鍵詞：達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系的建立與蛋白表達(dá)特性研究

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【摘要】：昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞工程中的主要領(lǐng)域之一,廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)及生物學(xué)的各個(gè)方面。特別是昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus Expression Victor System,BEVS)被廣泛用于重組蛋白表達(dá)、工程疫苗和蛋白組學(xué)等領(lǐng)域,擁有巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。本文以鱗翅目(Lepidoptera)鳳蝶科(Papilionidae)的達(dá)摩鳳蝶Papilio demoleus Linnaeus新孵幼蟲為試驗(yàn)材料,建立了4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系,并對(duì)其原代及傳代培養(yǎng)方法、基礎(chǔ)生物學(xué)特性、凍存與復(fù)蘇特性、病毒敏感性,以及對(duì)外源蛋白表達(dá)水平等方面進(jìn)行了較詳盡的研究。新昆蟲細(xì)胞系的建立不但為離體條件下進(jìn)行相關(guān)的昆蟲生理生化、桿狀病毒感染等研究提供實(shí)驗(yàn)材料,也為昆蟲細(xì)胞系的建立研究、昆蟲細(xì)胞工程研究奠定了一定的科學(xué)基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:1、達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系的建立使用改良的Grace培養(yǎng)基并輔以20%胎牛血清對(duì)達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲組織進(jìn)行體外培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)2年多的培養(yǎng),最終有4瓶培養(yǎng)物傳代超過(guò)50次且生物學(xué)特性穩(wěn)定、生長(zhǎng)一直良好,成為可穩(wěn)定傳代的達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系,分別命名為RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2、RIRI-Pa De-3,以及RIRI-Pa De-4。2、達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系的基礎(chǔ)生物學(xué)特性(1)細(xì)胞系來(lái)源的分子鑒定:通過(guò)比對(duì)4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系和蟲卵的細(xì)胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)序列,結(jié)果顯示來(lái)源于4株細(xì)胞系和蟲卵的COI序列相似度為100%,證明4個(gè)新建細(xì)胞系來(lái)源于達(dá)摩鳳蝶組織。(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征:4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系均為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞,培養(yǎng)初期細(xì)胞種類多樣,進(jìn)入穩(wěn)定傳代期后,各細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)組成出現(xiàn)一定差異。RIRI-Pa De-1細(xì)胞形態(tài)主要為圓形、梭形和多邊形,其中圓形細(xì)胞占61.73±1.33%,直徑從7.06μm至35.112μm不等,懸浮狀態(tài)下細(xì)胞群體的平均直徑為6.79±0.27μm。RIRI-Pa De-2細(xì)胞形態(tài)主要為圓形,直徑從7.14μm至27.66μm不等,平均直徑為13.920±0.025μm,懸浮狀態(tài)下細(xì)胞群體的平均直徑為6.87±0.27μm。RIRI-Pa De-3細(xì)胞形態(tài)主要為類似表皮細(xì)胞和纖維狀細(xì)胞,懸浮狀態(tài)下細(xì)胞群體的平均直徑為6.66±0.56μm。RIRI-Pa De-4細(xì)胞形態(tài)主要為圓形、梭形和多邊形,其中圓形細(xì)胞占58.35±4.22%,直徑平均為13.813±0.421μm,懸浮狀態(tài)下細(xì)胞群體的平均直徑為6.71±0.47μm。(3)細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)特性:通過(guò)試驗(yàn)繪制了4個(gè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線,計(jì)算各個(gè)細(xì)胞系的群體倍增時(shí)間分別為:RIRI-Pa De-1是69.77h,RIRI-Pa De-2是67.42h,RIRI-Pa De-3是81.48h,RIRI-Pa De-4是65.43h,其中,RIRI-Pa De-4細(xì)胞增殖一倍所需時(shí)間最短,RIRIPa De-3細(xì)胞系的倍增時(shí)間最長(zhǎng)。(4)核型分析:經(jīng)過(guò)試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn),制片時(shí)使用的KCl低滲溶液最適濃度為0.60%。在1000倍光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),4個(gè)達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系的染色體呈點(diǎn)狀聚集于核區(qū),雖然數(shù)量眾多,但統(tǒng)計(jì)結(jié)果呈正態(tài)分布。細(xì)胞系RIRI-Pa De-1(61代)的染色體數(shù)目分布區(qū)間為36~90,平均為63條;RIRI-Pa De-2(60代)的染色體數(shù)目分布區(qū)間為49~97,平均為73條;RIRI-Pa De-3(52代)的染色體數(shù)目分布區(qū)間為46~90,平均為68條;RIRI-Pa De-4(52代)的染色體數(shù)目分布區(qū)間為45~91,平均為68條。(5)凍存與復(fù)蘇特性:通過(guò)對(duì)4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系進(jìn)行長(zhǎng)期液氮深低溫冷凍保存,分析凍存時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)細(xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示4個(gè)細(xì)胞系經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期凍后活力均呈下降趨勢(shì)。但復(fù)蘇培養(yǎng)后能在短期(10d)內(nèi)恢復(fù)活力,且生長(zhǎng)特性不變,說(shuō)明使用常規(guī)凍存操作方法能夠?qū)崿F(xiàn)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系在液氮中的長(zhǎng)期保存與復(fù)蘇。3、達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對(duì)6種昆蟲桿狀病毒的敏感性使用6種常見鱗翅目昆蟲桿狀病毒(苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Ac MNPV、家蠶核型多角體病毒Bm NPV、春尺蠖核型多角體病毒Aci NPV、美國(guó)白蛾核型多角體病毒Hycu NPV、舞毒蛾核型多角體病毒Ld NPV,以及柞蠶核型多角體病毒Anpe NPV)對(duì)4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系進(jìn)行侵染測(cè)試,觀察4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對(duì)病毒的反應(yīng),確定能夠侵染達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系的病毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ac MNPV能感染4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系;Aci NPV和Hycu NPV均可感染RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2、RIRI-Pa De-4,不能感染RIRI-Pa De-3;其余3株病毒均不能感染達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系。表明,4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系都對(duì)Ac MNPV敏感,RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2,以及RIRI-Pa De-4細(xì)胞系對(duì)Aci NPV和Hycu NPV敏感;4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對(duì)Bm NPV、Ld NPV,以及Anpe NPV均不敏感。4、對(duì)3種報(bào)告基因表達(dá)水平的研究為了研究4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對(duì)重組外源基因的表達(dá)特性,本論文利用Bac-to-Bac#174;桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了3株攜帶不同報(bào)告基因的重組桿狀病毒,分別為重組綠色熒光蛋白桿狀病毒Ac MNPV-GFP、重組β-半乳糖苷酶桿狀病毒Ac MNPV-Lac Z,以及重組分泌型堿性磷酸酶桿狀病毒Ac MNPV-SEAP。通過(guò)感染達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系和作為對(duì)照的Sf9和High Five細(xì)胞系,檢測(cè)和比較重組蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá)水平。(1)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對(duì)Ac MNPV-GFP敏感性:使用有限稀釋法,測(cè)定達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系、Sf9,以及High Five對(duì)Ac MNPV-GFP的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Median Tissue Culture Infectious Dose,TCID50),獲得結(jié)果為:RIRI-Pa De-2和RIRI-Pa De-4表達(dá)的綠色熒光蛋白量及其微弱,鏡檢無(wú)法觀測(cè)到;High Five的TCID50最小(10-6.88),說(shuō)明對(duì)Ac MNPV-GFP最敏感,其次是RIRI-Pa De-1(TCID50=10-6.55),之后為Sf9(TCID50=10-6.5),對(duì)Ac MNPVGFP敏感度最低的是RIRI-Pa De-3(TCID50=10-5.45)。(2)重組綠色熒光蛋白在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平:Sf9對(duì)重組綠色熒光蛋白的表達(dá)量最高。雖然細(xì)胞系RIRI-Pa De-1對(duì)Ac MNP-GFP敏感性比Sf9高,但重組綠色熒光蛋白的表達(dá)水平僅為Sf9的1/10,RIRI-Pa De-3的表達(dá)水平為Sf9的1/18,RIRI-Pa De-2和RIRI-Pa De-4的表達(dá)水平為Sf9的1/27,High Five表達(dá)重組綠色熒光蛋白的水平為Sf9的一半。(3)重組β-半乳糖苷酶在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平:重組β-半乳糖苷酶在4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平均很低。接種Ac MNPV-Lac Z病毒48h后Sf9和High Five便開始顯著表達(dá)重組β-半乳糖苷酶,此時(shí)4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中重組β-半乳糖苷酶活性非常低。96h后RIRI-Pa De-3細(xì)胞中檢測(cè)到重組β-半乳糖苷酶活性升高,但僅為Sf9中β-半乳糖苷酶活性的1/11。216h后重組β-半乳糖苷酶在6個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)量達(dá)到最大,High Five最高,其次為Sf9,RIRI-Pa De-3僅為High Five的1/8,RIRI-Pa De-4表達(dá)量排第4,約為High Five表達(dá)水平的1/18,RIRI-Pa De-2約為High Five的1/24,RIRI-Pa De-1表達(dá)水平最低。(4)重組分析型堿性磷酸酶在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平:重組SEAP在4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平與Sf9和High Five的相當(dāng)甚至更高。接種Ac MNPV-SEAP病毒48h后6個(gè)細(xì)胞系均顯著表達(dá)重組SEAP。144h時(shí)RIRI-Pa De-1和RIRI-Pa De-2的表達(dá)量達(dá)增加最快。169h后各細(xì)胞系均達(dá)到表達(dá)最高峰,相互之間表達(dá)量相差不大。216h后各除RIRI-Pa De-3外,其他5個(gè)細(xì)胞系表達(dá)重組SEAP的水平均開始下降。到240h時(shí),RIRI-Pa De-3仍保持較高的重組SEAP表達(dá)水平。結(jié)果表明,4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對(duì)重組SEAP的表達(dá)水平與Sf9和High Five相當(dāng),其中RIRI-Pa De-3細(xì)胞系對(duì)重組SEAP的表達(dá)水平顯著高于Sf9和High Five,有開發(fā)和利用其作為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)宿主細(xì)胞系的潛力。綜上所述,本文以達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲為試驗(yàn)材料建立了4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系,其基礎(chǔ)生物學(xué)特性、病毒敏感性,以及對(duì)外源蛋白表達(dá)水平等方面均有差異:4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系均對(duì)Ac MNPV敏感,3個(gè)細(xì)胞系(RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2,以及RIRI-Pa De-4)對(duì)Aci NPV和Hycu NPV敏感;4個(gè)達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對(duì)重組綠色熒光蛋白和β-半乳糖苷酶的表達(dá)水平均較低,但對(duì)重組分泌型堿性磷酸酶的表達(dá)水平高于Sf9和High Five,具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：達(dá)摩鳳蝶 昆蟲細(xì)胞系 桿狀病毒 報(bào)告基因 表達(dá)水平
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;Q813
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-20
• 第一章 緒論20-32
• 1.1 引言20-21
• 1.1.1 研究背景20
• 1.1.2 研究目的和意義20-21
• 1.1.3 項(xiàng)目來(lái)源與經(jīng)費(fèi)支持21
• 1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀與評(píng)述21-29
• 1.2.1 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的一般概況21-22
• 1.2.2 昆蟲細(xì)胞的研究、應(yīng)用現(xiàn)狀以及發(fā)展趨勢(shì)22-29
• 1.3 研究目標(biāo)和主要研究?jī)?nèi)容29-31
• 1.3.1 研究目標(biāo)29-30
• 1.3.2 研究的主要內(nèi)容30-31
• 1.4 研究技術(shù)路線31-32
• 第二章 達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系的建立及生物學(xué)特性研究32-57
• 2.1 試驗(yàn)材料與方法32-40
• 2.1.1 試驗(yàn)材料32-34
• 2.1.2 試驗(yàn)方法34-40
• 2.2 結(jié)果與分析40-55
• 2.2.1 達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系的建立40-44
• 2.2.2 達(dá)摩鳳蝶新孵幼蟲細(xì)胞系的生物學(xué)特性44-53
• 2.2.3 達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系的凍存與復(fù)蘇53-55
• 2.3 小結(jié)55-57
• 第三章 達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系的病毒敏感性研究57-67
• 3.1 試驗(yàn)材料與方法57-59
• 3.1.1 試驗(yàn)材料57-59
• 3.1.2 試驗(yàn)方法59
• 3.2 結(jié)果與分析59-66
• 3.2.1 RIRI-PaDe-1 細(xì)胞系對(duì)6種昆蟲桿狀病毒的敏感性59-60
• 3.2.2 RIRI-PaDe-2 細(xì)胞系對(duì)6種昆蟲桿狀病毒的敏感性60
• 3.2.3 RIRI-PaDe-3 細(xì)胞系對(duì)6種昆蟲桿狀病毒的敏感性60-65
• 3.2.4 RIRI-PaDe-4 細(xì)胞系對(duì)6種昆蟲桿狀病毒的敏感性65-66
• 3.3 小結(jié)66-67
• 第四章 重組綠色熒光蛋白在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)67-81
• 4.1 試驗(yàn)材料與方法67-76
• 4.1.1 試驗(yàn)材料67-70
• 4.1.2 試驗(yàn)方法70-76
• 4.2 結(jié)果與分析76-80
• 4.2.1 重組綠色熒光蛋白桿狀病毒(AcMNPV-GFP)的構(gòu)建結(jié)果76-78
• 4.2.2 達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對(duì)AcMNPV-GFP的敏感性78-79
• 4.2.3 重組GFP在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中表達(dá)量的測(cè)定79-80
• 4.3 小結(jié)80-81
• 4.3.1 達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系對(duì)AcMNPV-GFP的敏感性80
• 4.3.2 重組GFP在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)水平80-81
• 第五章 重組 β-半乳糖苷酶在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)81-93
• 5.1 試驗(yàn)材料與方法81-87
• 5.1.1 試驗(yàn)材料81-83
• 5.1.2 試驗(yàn)方法83-87
• 5.2 結(jié)果與分析87-92
• 5.2.1 重組 β-半乳糖苷酶桿狀病毒(AcMNPV-LacZ)的構(gòu)建結(jié)果87-88
• 5.2.2 重組 β-半乳糖苷酶在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中表達(dá)量的測(cè)定88-92
• 5.3 小結(jié)92-93
• 第六章 重組分泌型堿性磷酸酶在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系的表達(dá)93-104
• 6.1 試驗(yàn)材料與方法93-99
• 6.1.1 試驗(yàn)材料93-95
• 6.1.2 試驗(yàn)方法95-99
• 6.2 結(jié)果與分析99-103
• 6.2.1 重組分泌型堿性磷酸酶桿狀病毒(AcMNPV-SEAP)的構(gòu)建結(jié)果99-100
• 6.2.2 重組分泌型堿性磷酸酶在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系中的表達(dá)的水平測(cè)定100-103
• 6.3 小結(jié)103-104
• 第七章 結(jié)論與討論104-116
• 7.1 結(jié)論104-107
• 7.2 創(chuàng)新點(diǎn)107
• 7.3 討論107-114
• 7.4 展望114-116
• 參考文獻(xiàn)116-129
• 在讀期間的學(xué)術(shù)研究129-130
• 致謝130

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張塏;余冰菲;陳瑞川;劉潤(rùn)忠;;熒光定量檢測(cè)細(xì)胞綠色熒光蛋白技術(shù)的建立與應(yīng)用[J];廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年S2期

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本文編號(hào)：806991