本文關(guān)鍵詞：犬瘟熱病毒N蛋白單克隆抗體的制備和特性研究及犬細(xì)小病毒VP2基因變異分析

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【摘要】：犬瘟熱(Canine Distemper,CD)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。犬細(xì)小病毒性腸炎是由犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus,CPV)引起的以腸炎、腹瀉與主的烈性傳染病。為了更好的控制與預(yù)防上述兩種疫病的流行,本研究開展了犬瘟熱病毒N蛋白單克隆抗體的制備和特性研究及犬細(xì)小病毒VP2基因變異分析。首先,本研究以CDV3的RNA為模板,原核表達(dá)純化了帶His標(biāo)簽的N蛋白截短片段(aa277-471),免疫BALB/c雌鼠后,將其B淋巴細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,通過包被N蛋白截短片段(aa277-471)的ELISA篩選,獲得分泌抗CDV的單克隆抗體雜交瘤陽(yáng)性細(xì)胞1株,命名為1N8,亞類鑒定為Ig G1a,kappa鏈,該單克隆抗體間接免疫熒光檢測(cè)陽(yáng)性、WB檢測(cè)陽(yáng)性。接下來采用噬菌體展示和肽掃描的方法,篩選1N8結(jié)合的抗原表位:合成N蛋白(aa277-471)的15肽文庫(kù),每條多肽長(zhǎng)度15aa,位移5aa,通過結(jié)合和篩選,得到一條與單克隆抗體1N8陽(yáng)性反應(yīng)的多肽,通過多肽N端和C端的不斷縮減,最終證明該抗原表位的最小識(shí)別單位:351NFGRSYFDP359。通過3D模擬,發(fā)現(xiàn)此表位位于N蛋白的外側(cè),其與CDV陽(yáng)性血清具備一定的ELISA反應(yīng)能力。通過比對(duì),其與CDV同屬麻疹病毒、牛瘟病毒,小反芻獸疫病毒一致,并對(duì)小反芻獸疫病毒進(jìn)行了WB驗(yàn)證,其結(jié)果為陽(yáng)性。以雜交瘤細(xì)胞1N8為模板,分離出抗體輕鏈和重鏈可變區(qū),通過基因工程的方式組裝成單鏈抗體,通過原核表達(dá),獲得了重組1N8單鏈抗體蛋白,經(jīng)過間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè),其具備1N8單抗的部分活性。以腺病毒為表達(dá)載體,研究了351NFGRSYFDP359表位疫苗的免疫效力:構(gòu)建含351NFGRSYFDP359表位和腸炎細(xì)小病毒VP2基因的表達(dá)盒,通過PCR和WB檢測(cè),重組腺病毒在核酸和蛋白水平上均能表達(dá)出外源片段。小鼠免疫試驗(yàn)顯示:與商品化對(duì)照疫苗相比,重組腺病毒的CPV的ELISA效價(jià)與之相當(dāng),但CDV的ELISA效價(jià)比較低。最后,在本研究開展了CPV VP2基因遺傳變異研究:歷經(jīng)4年,收集到我國(guó)主要城市的犬細(xì)小病毒陽(yáng)性樣品37份,分離病毒8株,獲得犬細(xì)小病的陽(yáng)性樣品VP2基因序列22份,其中CPV-2a型20份,CPV-2b型2份,測(cè)序結(jié)果顯示我國(guó)CPV存在CPV-2a(Ser297Ala)變異,而且CPV VP2基因序列相似度為99.3-99.9%,系統(tǒng)發(fā)育樹證明本次分離的大多數(shù)CPV毒株為一個(gè)大的分支中,與泰國(guó)KU143-09株類似,且不呈現(xiàn)地域相關(guān)性。
【關(guān)鍵詞】：犬瘟熱病毒 核蛋白 單克隆抗體 犬細(xì)小病毒 遺傳變異
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.655
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-16
• 英文縮略表16-17
• 第一章 引言17-30
• 1.1 犬瘟熱病毒17-21
• 1.1.1 犬瘟熱病毒病原學(xué)17-19
• 1.1.2 犬瘟熱病毒基因組及N蛋白研究進(jìn)展19-21
• 1.2 犬瘟熱病毒單克隆抗體的研究21-23
• 1.2.1 犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備21
• 1.2.2 犬瘟熱病毒B細(xì)胞表位21-22
• 1.2.3 犬瘟熱病毒單鏈抗體22-23
• 1.3 犬瘟熱病毒診斷技術(shù)研究23-24
• 1.3.1 犬瘟熱病毒病原學(xué)診斷24
• 1.3.2 犬瘟熱病毒血清學(xué)診斷24
• 1.4 犬瘟熱病毒疫苗研究進(jìn)展24-25
• 1.4.1 犬瘟熱病毒毒株及疫苗24-25
• 1.4.2 犬瘟熱病毒新型疫苗25
• 1.4.3 犬瘟熱病毒免疫失敗原因25
• 1.5 腺病毒作為載體在動(dòng)物疫苗中的研究進(jìn)展25-26
• 1.6 肉食動(dòng)物細(xì)小病毒26-29
• 1.6.1 肉食動(dòng)物細(xì)小病毒概述26-27
• 1.6.2 基因組特征27
• 1.6.3 犬細(xì)小病毒27-28
• 1.6.4 犬細(xì)小病毒變異和VP2蛋白氨基酸突變28
• 1.6.5 我國(guó)犬細(xì)小病毒流行狀況28-29
• 1.7 研究的目的和意義29-30
• 第二章 CDV N蛋白單克隆抗體的制備30-41
• 摘要30
• 2.1 材料與方法30-36
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑30-31
• 2.1.2 毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物31
• 2.1.3 主要儀器和耗材31
• 2.1.4 N蛋白截短蛋白(aa277-471)基因PCR31
• 2.1.5 N蛋白截短蛋白(aa277-471)表達(dá)載體構(gòu)建31-32
• 2.1.6 p EASY-N表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)32-33
• 2.1.7 重組CDV-N蛋白表達(dá)預(yù)處理33
• 2.1.8 N蛋白表達(dá)Ni-NTA純化33
• 2.1.9 N蛋白SDS-PAGE分析33
• 2.1.10 CDV-N蛋白免疫程序33
• 2.1.11 N蛋白間接ELISA檢測(cè)方法的建立33-34
• 2.1.12細(xì)胞融合試驗(yàn)34
• 2.1.13陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選34
• 2.1.14 MAbs腹水的制備34-35
• 2.1.15間接免疫熒光（IFA）鑒定35
• 2.1.16 MAb的Western blot鑒定35
• 2.1.17 MAb上清與腹水效價(jià)測(cè)定以及亞類鑒定35
• 2.1.18 MAb 的初步應(yīng)用：抗體與 HRP 及 488 偶聯(lián)35-36
• 2.2 結(jié)果36-40
• 2.2.1 N基因的PCR擴(kuò)增36
• 2.2.2 重組供體質(zhì)粒p EASY-N的鑒定36
• 2.2.3 p EASY-N重組質(zhì)粒的表達(dá)與純化36-37
• 2.2.4 間接ELISA檢測(cè)法的建立37
• 2.2.5 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的獲得37
• 2.2.6 MAb上清與腹水效價(jià)測(cè)定以及亞型鑒定37-38
• 2.2.7 MAb的IFA鑒定38-39
• 2.2.8 MAb的Western blot鑒定39
• 2.2.9 MAb的初步應(yīng)用：抗體與HRP及488偶聯(lián)39-40
• 2.3 討論40-41
• 2.3.1 CDV單克隆抗體的制備40
• 2.3.2 選擇CDV N蛋白的原因40
• 2.3.3 CDV單克隆抗體國(guó)內(nèi)外應(yīng)用進(jìn)展40-41
• 第三章 篩選犬瘟熱病毒N蛋白（AA 277-471）B細(xì)胞表位41-50
• 摘要41
• 3.1 材料與方法41-44
• 3.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑41
• 3.1.2 單克隆抗體 1N8的純化41-42
• 3.1.3 噬菌體篩選與擴(kuò)增42
• 3.1.4 陽(yáng)性噬菌體序列測(cè)定42
• 3.1.5 犬瘟熱病毒N蛋白（aa277-471）合成肽的制備42-43
• 3.1.6 抗原表位的初步鑒定（肽掃描）43
• 3.1.7 抗原表位的精確鑒定43
• 3.1.8 抗原表位的特異性鑒定43
• 3.1.9 抗原表位合成多肽與CDV陽(yáng)性/陰性血清ELISA反應(yīng)43
• 3.1.10 抗原表位的 3D位置43-44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-48
• 3.2.1 單抗腹水純化44
• 3.2.2 肽庫(kù)淘選44
• 3.2.3 隨機(jī)噬菌體的測(cè)序結(jié)果44-45
• 3.2.4 肽掃描結(jié)果45
• 3.2.5 抗原表位的精確鑒定45-46
• 3.2.6 抗原表位的比對(duì)46-47
• 3.2.7 1N8與小反芻獸疫病毒的WB檢驗(yàn)47
• 3.2.8 抗原表位351NFGRSYFDP359在N蛋白中的 3D位置47-48
• 3.2.9 抗原表位351NFGRSYFDP359與CDV陽(yáng)性血清反應(yīng)能力48
• 3.3 討論48-50
• 3.3.1 CDV N蛋白B細(xì)胞抗原表位48
• 3.3.2 麻疹病毒屬N蛋白抗原表位分析48-50
• 第四章 基于雜交瘤細(xì)胞 1N8的單鏈抗體制備與鑒定50-57
• 摘要50
• 4.1 材料與方法50-53
• 4.1.1 細(xì)胞與菌株50
• 4.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑50
• 4.1.3 引物設(shè)計(jì)50-51
• 4.1.4 雜交瘤的RNA提取，c DNA合成和基因擴(kuò)增51
• 4.1.5 單鏈抗體sc Fv/1N8 gene的合成51
• 4.1.6 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建51-52
• 4.1.7 單鏈抗體基因的序列比對(duì)分析52
• 4.1.8 單鏈抗體的表達(dá)52
• 4.1.9 重組蛋白的純化52
• 4.1.10 重組蛋白的復(fù)性52
• 4.1.11 蛋白濃度的測(cè)定52-53
• 4.1.12 單鏈抗體活性檢測(cè)53
• 4.2 結(jié)果53-56
• 4.2.1 sc Fv/1N8 gene基因的擴(kuò)增結(jié)果53
• 4.2.2 sc Fv/1N8 gene基因的序列分析53-54
• 4.2.3 sc Fv/1N8重組蛋白的表達(dá)與純化54
• 4.2.4 sc Fv/1N8重組蛋白的活性檢測(cè)54-56
• 4.3 討論56-57
• 4.3.1 CDV單鏈抗體的研究56
• 4.3.2 CDV單鏈抗體的構(gòu)建方式56
• 4.3.3 CDV不同蛋白單鏈抗體的未來展望56-57
• 第五章 CDV 351NFGRSYFDP359表位疫苗研究57-65
• 摘要57
• 5.1 材料與方法57-59
• 5.1.1 腺病毒表達(dá)載體和試劑57
• 5.1.2 含目的基因(表位+VP2)的PCR擴(kuò)增57-58
• 5.1.3 含目的基因(表位+VP2)穿梭載體的構(gòu)建58
• 5.1.4 重組腺病毒載體菌內(nèi)重組鑒定58
• 5.1.5 重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞58
• 5.1.6 重組腺病毒滴度（TCID50）的滴定58
• 5.1.7 重組腺病毒的形態(tài)學(xué)觀察58
• 5.1.8 重組腺病毒的PCR鑒定58-59
• 5.1.9 重組腺病毒的WB鑒定59
• 5.1.10 重組病毒免疫小鼠實(shí)驗(yàn)59
• 5.2 結(jié)果59-63
• 5.2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果59
• 5.2.2 含目的基因(表位+VP2)穿梭載體的構(gòu)建結(jié)果59-60
• 5.2.3 重組腺病毒的包裝60
• 5.2.4 重組病毒滴度（TCID50）的測(cè)定60-61
• 5.2.5 重組腺病毒的電鏡觀察61
• 5.2.6 重組腺病毒的VP2基因PCR結(jié)果61-62
• 5.2.7 重組腺病毒的Western blot檢測(cè)62
• 5.2.8 重組腺病毒免疫小鼠后CPV抗體效價(jià)62
• 5.2.9 重組腺病毒免疫小鼠后CDV抗體效價(jià)62-63
• 5.3 討論63-65
• 5.3.1 腺病毒載體的優(yōu)勢(shì)63
• 5.3.2 CPV VP2基因的VLP特征63-64
• 5.3.3 CDV表位疫苗64-65
• 第六章 犬細(xì)小病毒VP2基因的遺傳變異分析65-78
• 摘要65
• 6.1 材料與方法65-68
• 6.1.1 菌株、載體和試劑65
• 6.1.2 CPV基因組提取方法65-66
• 6.1.3 用于CPV毒株遺傳進(jìn)化分析的毒株信息66
• 6.1.4 CPV PCR擴(kuò)增66-67
• 6.1.5 CPV特異性片段的PCR擴(kuò)增與RFLP分析67
• 6.1.6 CPV VP2基因的克隆67
• 6.1.7 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量法檢測(cè)CPV病毒含量67-68
• 6.1.8 犬細(xì)小病毒分離68
• 6.1.9 犬細(xì)小病毒系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建68
• 6.2 試驗(yàn)結(jié)果68-76
• 6.2.1 樣品中細(xì)小病毒的常規(guī)PCR鑒定68
• 6.2.2 犬細(xì)小病毒RFLP分析68-69
• 5.2.3 犬細(xì)小病毒病毒分離69
• 6.2.4 犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆69-70
• 6.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量方法測(cè)定細(xì)小病毒載量70
• 6.2.6 犬細(xì)小病毒VP2基因的序列分析70-71
• 5.2.7 犬細(xì)小病毒VP2基因的同義突變與非同義突變71
• 6.2.8 CPV VP2基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析71-76
• 6.3 討論76-78
• 6.3.1 我國(guó)CPV流行趨勢(shì)分析76
• 6.3.2 VP2蛋白氨基酸變異分析76-77
• 6.3.3 我國(guó)CPV免疫保護(hù)分析77
• 6.3.4 CPV及其他犬科動(dòng)物感染細(xì)小病毒聯(lián)系77-78
• 第六章 全文結(jié)論78-79
• 附錄79-84
• 參考文獻(xiàn)84-97
• 致謝97-98
• 作者簡(jiǎn)歷98

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張曉霞;馬軍武;周廣青;代鵬;林密;馮霞;;抗口蹄疫病毒單鏈抗體cDNA T7噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2013年03期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 殷秀辰;Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1基因重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫效果評(píng)價(jià)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

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本文編號(hào)：804273