本文關(guān)鍵詞：鴨產(chǎn)蛋下降相關(guān)新病毒的分子鑒定與生物學(xué)特性研究

  更多相關(guān)文章： 微RNA病毒 Aalivirus 小雙節(jié)RNA病毒 Dusavirus 鴨星狀病毒

【摘要】：近20年來(lái),鴨新發(fā)病毒性疾病不斷出現(xiàn),嚴(yán)重制約了我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。因此,開展鴨未知新病毒的探索研究日趨重要。 從廣東的6個(gè)發(fā)病蛋鴨群和4個(gè)康復(fù)蛋鴨群以及廣西的1個(gè)發(fā)病肉種鴨群和1個(gè)發(fā)病商品鴨場(chǎng)采集樣品,共計(jì)107份,針對(duì)坦布蘇病毒、布尼亞病毒、甲病毒、杯狀病毒、禽博爾納病毒(Avian bornavirus, AB V)、禽星狀病毒和微RNA病毒進(jìn)行了PCR檢測(cè)。從1份肉種鴨糞樣和2份商品肉鴨腸道樣品中檢出微RNA病毒；因ABV引物錯(cuò)配,從1份蛋鴨糞樣中檢出小雙節(jié)RNA病毒。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列分析的結(jié)果表明,鴨源微RNA病毒和鴨源小雙節(jié)RNA病毒(Duck picorbirnavirus, DuPBV)可能屬于2種新的病毒。 選GL/12株,用RT-PCR和5'/3'RACE技術(shù)測(cè)定了鴨源微RNA病毒的基因組序列。序列分析表明,GL/12株擁有微RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu),但亦有其自身的特點(diǎn)。該病毒的2A區(qū)編碼6種2A蛋白基序,包括4個(gè)含NPGP基序的2A(2A1-2A4)、1個(gè)AIG1.樣的2A5以及1個(gè)雙�？虏《緲拥�2A6；其5'UTR含有丙肝病毒/瘟病毒(Hepacivirus/pestivirus, HP)樣內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribosome entry site, IRES)。但是,該IRES的IIIe亞域由3-nt的莖和5-nt的環(huán)組成,與以往報(bào)道的HP樣IRES均有所不同。在P1、P2和P3區(qū),GL/12株與鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A virus, DHAV)的氨基酸序列同源性最高,分別為37.7%、39%和43.7%。進(jìn)化分析結(jié)果表明,GL/12株與DHAV和Avisivirus A (AsV-A)具有相近的遺傳演化關(guān)系,但變異性亦十分明顯。因此,將GL/12株鑒定為微RNA病毒科一個(gè)新屬的成員,暫將其屬名稱為Aalivirus,以Aalivirus A (AalV-A)作為代表種。 以廣東15個(gè)蛋鴨群的142份樣品為材料,用PBV特異性RT-PCR進(jìn)行了檢測(cè),從70份(49.3%)樣品中檢出DuPBV,表明DuPBV在蛋鴨中的感染較為普遍。對(duì)所測(cè)定的264條RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)序列進(jìn)行進(jìn)化分析的結(jié)果顯示,這些序列均屬PBV基因I群,其氨基酸同源性為56%--100%,表現(xiàn)出高度變異性。選DuPBV4-17株,用RT-PCR和5'RACE技術(shù)測(cè)定了基因組序列。序列分析表明,DuPBV4-17株基因組由兩個(gè)片段構(gòu)成,分別編碼衣殼蛋白和RdRp,符合PBV基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。同源性分析和進(jìn)化分析的結(jié)果表明,DuPBV4-17株與以往報(bào)道的PBV存在較大的序列變異性。在測(cè)定另外一株DuPBV(4-23株)的基因組序列時(shí),意外檢出Posavirus樣病毒的基因序列,以此為基礎(chǔ),測(cè)定了Posavirus樣病毒4-23株約78%的基因組序列。分析結(jié)果顯示,4-23株具有微RNA病毒目的基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。與Posavirus和Fisavirus類似,其非結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白編碼區(qū)分別位于基因組的5'和3'部分。用微RNA病毒目3CD和衣殼蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化分析的結(jié)果顯示,4-23株與Posavirus和Fisavirus具有相近的遺傳演化關(guān)系,但又表現(xiàn)出明顯的差異。建議在微RNA病毒目中為Posavirus和Fisavirus成立一個(gè)新的病毒科,且4-23株屬于該科中的一個(gè)新病毒屬的成員。暫將病毒屬名稱為Dusavirus,以Dusavirus A (DuV-A)作為其代表種。 2013年8月,在我國(guó)東北某金定麻鴨養(yǎng)殖區(qū),出現(xiàn)一種疑似鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis, DVH)的傳染病,該病可導(dǎo)致1-6周齡雛麻鴨和12周齡以上成年麻鴨發(fā)病和死亡,并可導(dǎo)致成年鴨產(chǎn)蛋下降。病鴨表現(xiàn)出DVH的特征臨床癥狀和病理變化,在成年鴨的卵巢,見有出血病變。組織病理學(xué)觀察顯示,病鴨各內(nèi)臟組織均有不同程度的出血、壞死和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。針對(duì)不同病原進(jìn)行分子檢測(cè)的結(jié)果顯示,鴨星狀病毒1型(Duck astrovirus1, DAstV-1)可能是致病病原。免疫組化試驗(yàn)和組織分布檢測(cè)結(jié)果顯示,DAstV-1可侵害多種不同的器官。用DAstV-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)感染試驗(yàn),可在雛北京鴨、雛麻鴨和成年麻鴨中復(fù)制出DVH。基因組測(cè)序和序列分析結(jié)果顯示,來(lái)自不同日齡的4株DAstV-1與以往報(bào)道的DAstV-1參考毒株C-NGB株具有相近的遺傳演化關(guān)系(氨基酸同源性為98-99%)。綜上所述,DAstV-1可導(dǎo)致成年鴨發(fā)生DVH。 基因組序列比較分析表明,相對(duì)于C-NGB株,所測(cè)4株DAstV-1的基因組存在18個(gè)氨基酸位點(diǎn)的共同突變,提示這些位點(diǎn)可能與DAstV-1對(duì)成年鴨的致病性有關(guān),因此,本研究以DAstV-1D17株為親本毒,構(gòu)建了覆蓋基因組全長(zhǎng)的cDNA克隆。用體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染BHK-21,隨后將細(xì)胞培養(yǎng)物接種LMH細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用熒光抗體對(duì)第3代LMH細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示,DAstV-1蛋白在細(xì)胞中獲得了表達(dá)。據(jù)此可認(rèn)為,病毒獲得了拯救。此結(jié)果為今后進(jìn)一步研究DAstV-1基因功能以及致病機(jī)理提供了良好的技術(shù)手段。
【關(guān)鍵詞】：微RNA病毒 Aalivirus 小雙節(jié)RNA病毒 Dusavirus 鴨星狀病毒
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 目錄7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-27
• 1.1 微RNA病毒12-15
• 1.1.1 病毒分類12
• 1.1.2 基因組結(jié)構(gòu)12-13
• 1.1.3 2A蛋白13-14
• 1.1.4 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)14
• 1.1.5 禽類微RNA病毒14-15
• 1.2 小雙節(jié)RNA病毒15-19
• 1.2.1 病毒發(fā)現(xiàn)的歷史概述15-16
• 1.2.2 PBV的分類16-17
• 1.2.3 PBV的基因組結(jié)構(gòu)17
• 1.2.4 PBV的基因分型17-18
• 1.2.5 PBV的致病性18-19
• 1.3 Posavirus及相關(guān)病毒19-20
• 1.3.1 Posavirus19-20
• 1.3.2 Fisavirus20
• 1.4 星狀病毒20-24
• 1.4.1 病毒發(fā)現(xiàn)的歷史概述20-21
• 1.4.2 病毒分類21-22
• 1.4.3 星狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)22
• 1.4.4 星狀病毒對(duì)禽類的致病性22-23
• 1.4.5 星狀病毒的診斷技術(shù)23-24
• 1.4.6 星狀病毒的反向遺傳操作技術(shù)24
• 1.5 近20年來(lái)鴨新發(fā)病毒病的流行概況24-25
• 1.6 研究目的和意義25-27
• 第二章 鴨源新病毒的分子檢測(cè)27-39
• 摘要27
• 2.1 前言27
• 2.2 材料27-29
• 2.2.1 臨床樣品27-28
• 2.2.2 主要試劑盒試劑盒28
• 2.2.3 主要試劑配制28-29
• 2.2.4 主要儀器設(shè)備29
• 2.3 方法29-32
• 2.3.1 樣品處理29
• 2.3.2 RNA提取29-31
• 2.3.3 RT-PCR31
• 2.3.4 PCR產(chǎn)物的回收和克隆31
• 2.3.5 PCR鑒定和測(cè)序31
• 2.3.6 序列分析31-32
• 2.4 結(jié)果32-37
• 2.4.1 RT-PCR檢測(cè)32-33
• 2.4.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與序列分析33
• 2.4.3 鴨源PBV的序列分析33
• 2.4.4 鴨源微RNA病毒的序列分析33-37
• 2.5 討論37-38
• 2.5.1 關(guān)于樣品來(lái)源和所選檢測(cè)方法37-38
• 2.5.2 關(guān)于鴨源新病毒38
• 2.6 小結(jié)38-39
• 第三章 鴨源新微RNA病毒的分子鑒定39-58
• 摘要39
• 3.1 前言39-40
• 3.2 材料40
• 3.2.1 臨床樣品40
• 3.2.2 鴨胚和SPF雞胚40
• 3.2.3 主要試劑、試劑盒和儀器設(shè)備40
• 3.3 方法40-43
• 3.3.1 病毒分離40
• 3.3.2 基因組測(cè)序40-42
• 3.3.3 序列分析42-43
• 3.4 結(jié)果43-55
• 3.4.1 病毒培養(yǎng)43
• 3.4.2 基因組測(cè)序43-44
• 3.4.3 基因組結(jié)構(gòu)分析44
• 3.4.4 同源性分析和進(jìn)化分析44-50
• 3.4.5 聚蛋白裂解位點(diǎn)預(yù)測(cè)50-51
• 3.4.6 蛋白質(zhì)基序分析51-53
• 3.4.7 IRES二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)53-55
• 3.4.8 3'UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)55
• 3.5 討論55-57
• 3.5.1 鴨源微RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)55-56
• 3.5.2 鴨源微RNA病毒非編碼區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)56-57
• 3.5.3 鴨源微RNA病毒的分類地位57
• 3.6 小結(jié)57-58
• 第四章 鴨源小雙節(jié)RNA病毒的分子檢測(cè)與鑒定58-72
• 摘要58
• 4.1 前言58
• 4.2 材料58-59
• 4.2.1 臨床樣品58-59
• 4.2.2 鴨胚59
• 4.2.3 主要試劑、試劑盒和儀器設(shè)備59
• 4.3 方法59-62
• 4.3.1 樣品處理和RNA提取59
• 4.3.2 RT-PCR檢測(cè)59
• 4.3.3 病毒分離和培養(yǎng)59-61
• 4.3.4 DuPBV 4-17株基因組測(cè)序61-62
• 4.3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)62
• 4.3.6 序列分析62
• 4.4 結(jié)果62-68
• 4.4.1 分子檢測(cè)63-65
• 4.4.2 DuPBV的變異性分析65
• 4.4.3 病毒培養(yǎng)65
• 4.4.4 SDS-PAGE65
• 4.4.5 基因組測(cè)序65-67
• 4.4.6 基因組結(jié)構(gòu)分析67-68
• 4.4.7 衣殼蛋白和RNA聚合酶的同源性分析和進(jìn)化分析68
• 4.5 討論68-71
• 4.5.1 DuPBV的基因組結(jié)構(gòu)68
• 4.5.2 DuPBV的分類68-70
• 4.5.3 蛋鴨群中DuPBV的感染和變異70-71
• 4.5.4 關(guān)于Posavirus樣病毒的發(fā)現(xiàn)71
• 4.6 小結(jié)71-72
• 第五章 鴨源Posavirus樣病毒的分子鑒定72-80
• 摘要72
• 5.1 前言72
• 5.2 材料72-73
• 5.2.1 毒株72
• 5.2.2 鴨胚72-73
• 5.2.3 主要試劑、試劑盒和儀器設(shè)備73
• 5.3 方法73-74
• 5.3.1 病毒分離73
• 5.3.2 基因組測(cè)序73-74
• 5.3.3 序列分析74
• 5.4 結(jié)果74-77
• 5.4.1 病毒分離75
• 5.4.2 基因組測(cè)序75
• 5.4.3 基因組結(jié)構(gòu)分析75-77
• 5.4.4 同源性分析和進(jìn)化分析77
• 5.5 討論77-79
• 5.5.1 鴨源Posavirus樣病毒4-23株的基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)77-79
• 5.5.2 鴨源Posavirus樣病毒4-23株的分類地位79
• 5.6 小結(jié)79-80
• 第六章 導(dǎo)致成年麻鴨發(fā)生DVH的DAstV-1的生物學(xué)特性研究80-112
• 摘要80
• 6.1 前言80-81
• 6.2 材料81-82
• 6.2.1 臨床樣品81-82
• 6.2.2 血清、細(xì)胞、SPF雞胚、鴨胚和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物82
• 6.2.3 主要試劑和試劑盒82
• 6.3 方法82-89
• 6.3.1 核酸提取84
• 6.3.2 反轉(zhuǎn)錄84
• 6.3.3 PCR84
• 6.3.4 PCR產(chǎn)物的回收84
• 6.3.5 連接和轉(zhuǎn)化84-85
• 6.3.6 PCR鑒定及測(cè)序85-86
• 6.3.7 基因組序列測(cè)定86
• 6.3.8 序列分析86
• 6.3.9 病毒的分離和培養(yǎng)86-87
• 6.3.10 自然病例的組織病理學(xué)檢查87
• 6.3.11 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)87-88
• 6.3.12 感染鴨群排毒期的監(jiān)測(cè)88
• 6.3.13 組織分布檢測(cè)88
• 6.3.14 感染試驗(yàn)88-89
• 6.4 結(jié)果89-107
• 6.4.1 流行病學(xué)特點(diǎn)和臨床癥狀89-90
• 6.4.2 自然病例的大體病變90
• 6.4.3 自然病例的組織病理學(xué)變化90-97
• 6.4.4 病原的分子鑒定97-99
• 6.4.5 病毒的分離和培養(yǎng)99-101
• 6.4.6 自然病例的免疫組織化學(xué)101-102
• 6.4.7 DAstV-1排毒期的監(jiān)測(cè)102
• 6.4.8 致病性試驗(yàn)102-104
• 6.4.9 DAstV-1的組織分布檢測(cè)104-105
• 6.4.10 DAstV-1基因組結(jié)構(gòu)和序列分析105-107
• 6.5 討論107-111
• 6.5.1 關(guān)于DAstV-1所引起的DVH107-108
• 6.5.2 關(guān)于病原的分離和鑒定108-110
• 6.5.3 關(guān)于DAstV-1的感染和傳播途徑110-111
• 6.6 小結(jié)111-112
• 第七章 DAstV-1的反向遺傳操作技術(shù)初探112-120
• 摘要112
• 7.1 前言112
• 7.2 材料112-113
• 7.2.1 病毒、細(xì)胞、載體和血清112
• 7.2.2 主要試劑和試劑盒112-113
• 7.3 方法113-117
• 7.3.1 基因組分段擴(kuò)增113-114
• 7.3.2 中間質(zhì)粒的構(gòu)建114
• 7.3.3 中間質(zhì)粒的同義突變114
• 7.3.4 DAstV-1 D17株全長(zhǎng)質(zhì)粒的連接114-115
• 7.3.5 DAstV-1 D17株全長(zhǎng)質(zhì)粒的測(cè)序115
• 7.3.6 全長(zhǎng)質(zhì)粒的線化和純化115
• 7.3.7 體外轉(zhuǎn)錄與RNA純化115-116
• 7.3.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染116
• 7.3.9 免疫熒光檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)116-117
• 7.4 結(jié)果117-119
• 7.4.1 DAstV-1 D17株全基因組的擴(kuò)增117
• 7.4.2 全長(zhǎng)質(zhì)粒pWSK-D17的酶切鑒定117-118
• 7.4.3 pWSK-D17的測(cè)序結(jié)果118
• 7.4.4 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果118
• 7.4.5 DAstV-1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果118-119
• 7.5 討論119
• 7.5.1 DAstV-1感染性克隆的構(gòu)建119
• 7.5.2 關(guān)于DAstV-1拯救病毒的繁殖119
• 7.6 小結(jié)119-120
• 第八章 結(jié)論120-121
• 第九章 創(chuàng)新點(diǎn)121-122
• 參考文獻(xiàn)122-140
• 致謝140-142
• 個(gè)人簡(jiǎn)介142

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 傅光華;程龍飛;施少華;彭春香;陳紅梅;黃瑜;;鴨圓環(huán)病毒全基因組克隆與序列分析[J];病毒學(xué)報(bào);2008年02期

2 劉鴻;陸新浩;任祖伊;朱夢(mèng)代;黃建勇;吳勇;楊民;;番鴨“新肝病”在浙江的流行情況及防控措施[J];浙江畜牧獸醫(yī);2010年06期

3 胡奇林,陳少鶯,江斌,程曉霞,林天龍,李怡英,程由銓;一種新的番鴨疫病(暫名番鴨肝白點(diǎn)病)病原的發(fā)現(xiàn)[J];福建畜牧獸醫(yī);2000年06期

4 程由銓,胡奇林,陳少鶯,程曉霞,李怡英,林天龍;番鴨花肝病(暫定名)活疫苗的研究[J];福建畜牧獸醫(yī);2001年06期

5 吳寶成,陳家祥,姚金水,陳枝華,陳文列,李國(guó)平,曾顯成;番鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J];福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年02期

6 張毓金,呂殿紅,黃庚明,黃忠,廖麗春;番鴨花肝病高免卵黃抗體的試驗(yàn)初報(bào)[J];廣東畜牧獸醫(yī)科技;2000年01期

7 潘夢(mèng);付余;王笑言;徐永亮;楊漢春;張大丙;;國(guó)內(nèi)新型鴨肝炎病毒基因組3′末端的序列特點(diǎn)[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年04期

8 王永坤;鴨流感防制研究進(jìn)展[J];中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊;2003年17期

9 仇保豐;劉武杰;彭大新;胡順林;劉秀梵;;近年來(lái)華東地區(qū)家鴨中禽流感病毒的亞型分布[J];微生物學(xué)報(bào);2008年10期

10 ;PCR Detection and Sequence Analysis of Duck Circovirus in Sick Muscovy Ducks[J];Virologica Sinica;2008年04期

，

本文編號(hào)：804155