本文關(guān)鍵詞：利用體細(xì)胞核移植制備腎臟特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因工具豬，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：囊性腎臟疾病(PKD)是常染色體顯性遺傳疾病,在臨床中較為常見,對人類健康構(gòu)成重大威脅�？蒲腥藛T期望通過動物模型揭示其致病機(jī)理。由于人和小鼠腎臟的生理學(xué)參數(shù)和解剖學(xué)特征顯著不同,因此基因修飾小鼠模型并不能很好地闡述人類囊性腎臟疾病過程。而豬作為一種動物模型,其器官大小、結(jié)構(gòu),以及生理學(xué)參數(shù)更接近人類,尤其適用于研究人類疾病。Cre-lox P重組酶系統(tǒng)是目前比較常用的構(gòu)建條件性基因敲除動物模型的基因修飾技術(shù)。Cre-lox P系統(tǒng)的應(yīng)用主要依賴于構(gòu)建時(shí)空特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因動物。利用發(fā)育特定時(shí)期或特定組織表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因動物與lox P序列錨定目的基因的轉(zhuǎn)基因動物雜交,其子代能夠達(dá)到條件性基因敲除的目的。水通道蛋白(Aquaporin)是一個(gè)跨膜水分子運(yùn)輸通道蛋白。AQP2(Aquaporin2)屬于水通道蛋白家族的一員,主要表達(dá)于哺乳動物腎臟組織。本研究利用8000bp大小的豬源AQP2啟動子片段驅(qū)動Cre表達(dá),構(gòu)建腎臟表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因工具豬。首先,分析了中國實(shí)驗(yàn)用小型豬不同組織中AQP2表達(dá)情況,并利用體外實(shí)驗(yàn)檢測了所構(gòu)建AQP2-Cre表達(dá)載體的表達(dá)活性。結(jié)果顯示,8000bp豬源AQP2啟動子區(qū)序列能夠驅(qū)動Cre重組酶在LLC-PK1細(xì)胞中高效表達(dá)。利用所構(gòu)建AQP2-Cre表達(dá)載體轉(zhuǎn)染中國實(shí)驗(yàn)用小型豬胎兒成纖維細(xì)胞,通過G418選擇性培養(yǎng)基篩選12天,獲得細(xì)胞克隆。PCR法鑒定細(xì)胞克隆后,利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因克隆豬。分析結(jié)果表明,健康出生的2頭豬均為陽性AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬。通過RT-PCR和Western Blotting證明轉(zhuǎn)基因小型豬的腎臟組織中表達(dá)Cre重組酶,而在其他檢測組織中不表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果證表明,轉(zhuǎn)基因小型豬的腎臟集合管細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶,而對照組正常小型豬沒有Cre重組酶表達(dá)。結(jié)果證明,本實(shí)驗(yàn)成功制備了腎臟組織表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小型豬。在Cre重組酶表達(dá)分析的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步分離了AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬腎臟細(xì)胞,并轉(zhuǎn)染檢測Cre重組酶活性的p CAG-LNL-RFP載體。結(jié)果表明,AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬的腎臟細(xì)胞具有Cre重組酶活性,能夠介導(dǎo)lox P序列之間的目的基因重組。利用q PCR和hi Tail-PCR分析了轉(zhuǎn)基因豬中Cre編碼序列的拷貝數(shù)以及整合位點(diǎn)。q PCR結(jié)果證明,在AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬中,Cre在不同組織的拷貝數(shù)為12-14;不同月齡轉(zhuǎn)基因小型豬基因組中Cre拷貝數(shù)同樣為12-14。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,在不同組織中以及不同月齡轉(zhuǎn)基因小型豬Cre拷貝數(shù)無明顯差異。Hi TAIL-PCR結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因小型豬基因中共有6個(gè)AQP2-Cre的整合位點(diǎn),它們隨機(jī)分布于染色體上的調(diào)控區(qū)或編碼區(qū)序列。基于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)之前的研究基礎(chǔ),本研究成功制備了AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因小型豬,該研究成果對制備敲除腎臟特異性基因豬模型奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Cre-loxp AQP2 體細(xì)胞核移植 轉(zhuǎn)基因豬 腎臟特異性
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;R692;R-332
【目錄】：

• 摘要4-6
• abstract6-13
• 前言13-15
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述15-27
• 第1章 囊性腎臟疾病與基因條件性敲除的研究進(jìn)展15-21
• 1.1 囊性腎病的分類15
• 1.2 多囊腎疾病分類15-16
• 1.3 多囊腎疾病的相關(guān)研究16-17
• 1.4 Cre/loxP系統(tǒng)17-19
• 1.4.1 Cre/loxp原理17-18
• 1.4.2 Cre-loxp應(yīng)用18-19
• 1.5 展望19-21
• 第2章 AQP2及體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因豬的研究進(jìn)展21-27
• 2.1 腎臟中水通道蛋白以及機(jī)體水平衡21-22
• 2.2 抗利尿激素對腎AQP2的調(diào)節(jié)22
• 2.3 AQP2調(diào)節(jié)機(jī)制22-23
• 2.4 豬體細(xì)胞核移植23-26
• 2.4.1 表觀重編程對體細(xì)胞核移植的影響24
• 2.4.2 受體細(xì)胞對體細(xì)胞核移植的影響24-25
• 2.4.3 供體細(xì)胞對體細(xì)胞核移植的影響25
• 2.4.4 環(huán)境因素對體細(xì)胞核移植的影響25
• 2.4.5 體細(xì)胞核移植的應(yīng)用25-26
• 2.5 展望26-27
• 第二篇 研究內(nèi)容27-79
• 第1章 AQP-Cre表達(dá)載體的構(gòu)建及分析27-45
• 前言27-28
• 1.1 材料和方法28-30
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 1.1.2 相關(guān)儀器28
• 1.1.3 主要溶液及試劑的配制28-30
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法30-36
• 1.2.1 引物設(shè)計(jì)30-31
• 1.2.2 總RNA提取31
• 1.2.3 c DNA合成31-32
• 1.2.4 RT-PCR32
• 1.2.5 組織蛋白提取32-33
• 1.2.6 Western Blotting分析33
• 1.2.7 構(gòu)建AQP2啟動子序列驅(qū)動Cre重組酶表達(dá)的表達(dá)載體33-36
• 1.2.8 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染36
• 1.3 結(jié)果36-42
• 1.3.1 分析AQP2在中國小型實(shí)驗(yàn)豬組織的表達(dá)36-37
• 1.3.2 腎特異性AQP2-Cre表達(dá)載體的構(gòu)建37-40
• 1.3.3 利用LLC-PK1細(xì)胞分析AQP2-Cre表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況40-42
• 1.4 討論42-44
• 1.5 小結(jié)44-45
• 第2章 表達(dá)AQP-Cre/loxp的轉(zhuǎn)基因豬的制備45-63
• 前言45
• 2.1 材料和方法45-53
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 2.1.2 相關(guān)儀器46
• 2.1.3 主要溶液及試劑的配制46-47
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法47-49
• 2.1.5 AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因豬各組織中Cre表達(dá)模式49-51
• 2.1.6 組織蛋白提取51
• 2.1.7 Western Blotting分析51-52
• 2.1.8 AQP2-Cre轉(zhuǎn)基因豬免疫組織化學(xué)分析52
• 2.1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)52-53
• 2.2 結(jié)果53-60
• 2.2.1 供體細(xì)胞的篩選53-54
• 2.2.2 Cre-AQP2轉(zhuǎn)基因豬的獲得54-56
• 2.2.3 Cre-AQP2轉(zhuǎn)基因豬的鑒定56-58
• 2.2.4 Western Blotting和免疫組化分析Cre蛋白在轉(zhuǎn)基因豬中的表達(dá)位置58-60
• 2.3 討論60-61
• 2.4 小結(jié)61-63
• 第3章 Cre重組酶在轉(zhuǎn)基因豬中的鑒定63-79
• 前言63-64
• 3.1 材料和方法64-71
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動物來源64
• 3.1.2 主要試劑64
• 3.1.3 相關(guān)儀器64
• 3.1.4 Cre重組酶功能分析64-65
• 3.1.5 qPCR分析轉(zhuǎn)基因Cre的拷貝數(shù)65-67
• 3.1.6 hiTAIL-PCR對整合位點(diǎn)的分析67-71
• 3.1.7 數(shù)據(jù)分析71
• 3.2 結(jié)果71-75
• 3.2.1 Cre重組酶重組效率分析71-72
• 3.2.2 AQP2-Cre基因拷貝數(shù)鑒定72-74
• 3.2.3 AQP2-Cre整合位點(diǎn)分析74-75
• 3.3 討論75-78
• 3.4 小結(jié)78-79
• 結(jié)論79-81
• 參考文獻(xiàn)81-92
• 導(dǎo)師簡介92-93
• 作者簡介及在讀期間取得的科研成果93-94
• 致謝94

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