發(fā)布時間：2017-05-29 19:00

  本文關(guān)鍵詞：桑樹成花素FT基因瞬時表達體系構(gòu)建與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：FT基因是開花信號通路的促進因子,是花發(fā)育通路的匯集點,整合來自光周期、春化和自主等不同花發(fā)育通路的信號,在高等植物花發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。FT基因不僅調(diào)節(jié)營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變,還控制著植物的生長節(jié)奏、生長與休眠之間的轉(zhuǎn)換。桑樹從播種到開花需要3-5年時間,這一漫長幼年期是遺傳育種研究的最大障礙,同時也是影響早期桑果產(chǎn)量的主要因素。桑樹成花素FT(MaFT)家族基因的表達和功能調(diào)控模式,至今沒有研究報道。論文圍繞MaFT基因在瞬時表達和嫁接桑樹中及轉(zhuǎn)化進擬南芥和苜蓿內(nèi)的功能展開研究。本研究主要結(jié)果如下:1.構(gòu)建pET28a-FT原核表達載體表達FT蛋白,蛋白以包涵體形式存在;利用His標簽純化蛋白,純化后蛋白通過尿素梯度法,經(jīng)透析膜進行復(fù)性,復(fù)性蛋白與弗氏佐劑、弗氏不完全佐劑融合后免疫新西蘭家兔,4次免疫后,獲得1:512,000高效價抗體。2.構(gòu)建植物pBE2113-FT-GFP雙元表達載體,轉(zhuǎn)化入GV3101,LBA4404農(nóng)桿菌菌株內(nèi)。蘸花法轉(zhuǎn)染野生型擬南芥,通過卡那霉素抗性、RT-PCR、免疫蛋白印跡篩選出陽性植株,得到轉(zhuǎn)基因擬南芥。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥提早10d左右出現(xiàn)早花現(xiàn)象,且葉片數(shù)平均只有5片,而野生型擬南芥平均生長出15個葉片時才開花。試驗結(jié)果表明,MaFT基因能夠促進擬南芥提早開花。3.將攜帶GUS的pBE2113質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌GV3101,LBA4404菌株內(nèi),通過優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達體系,發(fā)現(xiàn)在桑葉內(nèi),GV3101農(nóng)桿菌菌株更適合進行瞬時表達;選用OD600分別0.5、1.0、1.7三個菌體濃度進行瞬時表達,發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌菌體濃度對表達效率影響不大,最終選OD600為0.5作為瞬時表達的菌體濃度;比較不同基因型植株和葉片位置對瞬時表達的影響,結(jié)果表明:肉質(zhì)厚實的新鮮葉片比老葉片更利于瞬時表達效率的提高;組培苗和實生苗影響不大,選用幼齡期的實生苗作為表達對象。在桑樹葉片內(nèi)瞬時表達攜帶pBE2113-FT-GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株GV3101,倒置熒光顯微鏡觀察顯示,在桑樹葉片、葉柄,葉莖和頂芽內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有綠色熒光;實時定量PCR分析表明,瞬時表達后第4天葉片內(nèi)FT基因表達量最高,后逐漸下降;蛋白免疫印跡試驗表明FT蛋白可以通過篩管從葉片傳導(dǎo)到頂芽內(nèi)。4.為檢測桑樹FT基因的表達和FT蛋白的傳導(dǎo)規(guī)律,將1年生實生桑的枝條嫁接于20年生的植株上,實時定量PCR分析嫁接實生桑與同齡未嫁接實生桑葉片和頂芽內(nèi)的FT在mRNA水平上的變化。結(jié)果表明,在同齡未嫁接實生桑葉片內(nèi)FT相對表達量低,而嫁接三個月后實生桑成熟葉片內(nèi)的FT相對表達量升高;嫁接一年后實生桑葉片內(nèi)FT的相對表達量是嫁接當年的2倍,是同齡未嫁接實生桑相對表達量的3倍;兩年內(nèi)未嫁接實生桑葉片內(nèi)FT表達增加不明顯;免疫蛋白印跡試驗表明,嫁接一年后,在嫁接實生桑頂芽內(nèi)未檢測到FT蛋白,只在葉片內(nèi)檢測到FT蛋白。綜合qRT-PCR與Western blot結(jié)果分析,通過嫁接,成年桑樹內(nèi)的FT蛋白傳導(dǎo)進嫁接的實生桑內(nèi),導(dǎo)致FT蛋白含量升高,表明桑樹FT蛋白主要在葉片內(nèi)表達,FT蛋白可以從供體桑樹傳導(dǎo)到受體桑樹。5.優(yōu)化農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化苜蓿進行穩(wěn)定表達的條件,得到在共培養(yǎng)時間3天,農(nóng)桿菌的濃度0.6,Kan的最適篩選壓為50 mg/L,Carb最適濃度為500 mg/L時,苜蓿的轉(zhuǎn)化率最高。將桑樹FT基因轉(zhuǎn)化進苜蓿內(nèi),獲得了抗性胚性愈傷組織。對誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性胚狀體進行了針對FT和GFP基因的PCR檢測,篩選出陽性胚狀體,證明FT及GFP基因已整合到了苜蓿基因組中。本研究對于認識桑樹開花調(diào)控分子機理、促進桑果早期豐產(chǎn);調(diào)控開花基因表達;縮短童期,提早開花;提高育種效率具有重要理論意義和應(yīng)用價值。由于開花時一個復(fù)雜的過程,受自身和外界環(huán)境及很多途徑的調(diào)控以及桑樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法的限制。我們的研究還處于起步狀態(tài),關(guān)于MaFT基因調(diào)控桑樹成花,休眠等方面的機制還有待于更深一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：MaFT 桑樹 瞬時表達 擬南芥
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 文獻綜述14-28
• 1.1 高等植物成花研究概述14
• 1.2 高等植物成花基因研究進展14-18
• 1.2.1 光周期途徑14-15
• 1.2.2 春化途徑15-16
• 1.2.3 自主途徑16-18
• 1.3 FT基因研究進展18-21
• 1.3.1 FT基因的分子生物學(xué)和功能進化18-19
• 1.3.2 FT蛋白的作用模式19
• 1.3.3 FT基因調(diào)控開花過程19-21
• 1.3.4 FT基因調(diào)控休眠過程21
• 1.4 瞬時表達方法研究進展21-26
• 1.4.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達原理22
• 1.4.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法22
• 1.4.3 影響農(nóng)桿菌瞬時表達的因素22-25
• 1.4.4 瞬時表達技術(shù)的應(yīng)用25-26
• 1.5 本研究的選題依據(jù)與主要研究內(nèi)容26-28
• 1.5.1 選題依據(jù)26-27
• 1.5.2 本研究的主要內(nèi)容27-28
• 第二章 桑樹FT基因原核表達、蛋白純化及多克隆抗體的制備28-38
• 2.1 材料28
• 2.1.1 試驗材料28
• 2.1.2 試驗儀器28
• 2.2 方法28-32
• 2.2.1 桑葉總RNA提取28
• 2.2.2 FT片段的擴增28-29
• 2.2.3 重組載體的構(gòu)建29-31
• 2.2.4 FT基因在大腸桿菌中的表達及表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析31
• 2.2.5 重組蛋白的可溶性分析31
• 2.2.6 包涵體純化及復(fù)性31
• 2.2.7 多克隆抗體的制備31-32
• 2.2.8 多克隆抗體的檢測32
• 2.3 結(jié)果和分析32-36
• 2.3.1 FT基因的PCR擴增32
• 2.3.2 FT基因的T克隆32-33
• 2.3.3 FT基因原核表達載體的構(gòu)建及鑒定33-34
• 2.3.4 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析34
• 2.3.5 重組蛋白的可溶性分析及包涵體的純化34-35
• 2.3.6 純化后蛋白的復(fù)性35
• 2.3.7 復(fù)性蛋白的濃度測定35
• 2.3.8 多克隆抗體制備與ELISA檢測35-36
• 2.4 討論36-37
• 2.5 小結(jié)37-38
• 第三章 pBE2113-FT-GFP 植物表達載體構(gòu)建及促進擬南芥開花功能的研究38-47
• 3.1 試驗材料與試劑38
• 3.1.1 試驗材料38
• 3.1.2 試驗儀器38
• 3.2 試驗方法38-41
• 3.2.0 pBE2113-GFP載體構(gòu)建38-39
• 3.2.1 pBE2113-FT-GFP載體構(gòu)建39
• 3.2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化39-40
• 3.2.3 擬南芥的種植40
• 3.2.4 轉(zhuǎn)染用農(nóng)桿菌的準備40
• 3.2.5 轉(zhuǎn)染擬南芥40
• 3.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選40
• 3.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的RNA提取及RT-PCR檢測40-41
• 3.2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥Western blot鑒定41
• 3.2.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型分析41
• 3.3 結(jié)果41-45
• 3.3.1 GFP擴增和pBE2113-GFP載體構(gòu)建41-42
• 3.3.2 FT的擴增42
• 3.3.3 pBE2113-FT-GFP載體構(gòu)建42-43
• 3.3.4 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的檢測43
• 3.3.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的RT-PCR檢測43-44
• 3.3.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥Western blot檢測44-45
• 3.3.7 擬南芥的抗性篩選45
• 3.4 討論45-46
• 3.5 小結(jié)46-47
• 第四章 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達體系研究FT的功能47-59
• 4.1 材料與試劑47-48
• 4.1.1 試驗材料47
• 4.1.2 試驗所需溶液配制47-48
• 4.1.3 試驗儀器48
• 4.2 試驗方法48-51
• 4.2.1 用于瞬時轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的準備48
• 4.2.2 真空滲透法與注射器滲透法48
• 4.2.3 GUS染色方法與GFP熒光觀察48-49
• 4.2.4 瞬時表達條件的優(yōu)化49
• 4.2.5 桑樹FT基因的瞬時表達49-51
• 4.3 結(jié)果51-57
• 4.3.1 不同的滲透方法對表達的影響51
• 4.3.2 不同農(nóng)桿菌菌株對瞬時表達的影響51-52
• 4.3.3 不同菌體濃度對表達量的影響52
• 4.3.4 桑葉的生理狀態(tài)對瞬時表達的影響52-53
• 4.3.5 不同桑樹品種對瞬時表達的影響53
• 4.3.6 桑樹FT基因的瞬時表達53-55
• 4.3.7 注射滲透后FT表達量的變化55-56
• 4.3.8 RT-PCR檢測FT的表達56-57
• 4.3.9 瞬時表達蛋白的檢測57
• 4.4 討論57-58
• 4.5 小結(jié)58-59
• 第五章 FT蛋白在嫁接桑樹中的功能59-65
• 5.1 材料與試劑59-60
• 5.1.1 材料59
• 5.1.2 試驗試劑59
• 5.1.3 試驗儀器59-60
• 5.2 試驗方法60
• 5.2.1 嫁接60
• 5.2.2 總RNA提取60
• 5.2.3 Real time PCR60
• 5.2.4 蛋白提取60
• 5.2.5 Western blot檢測FT蛋白60
• 5.3 結(jié)果60-62
• 5.3.1 Real-time PCR檢測嫁接前后FT表達量60-61
• 5.3.2 桑樹葉片與頂芽內(nèi)總蛋白的提取61-62
• 5.3.3 FT蛋白的檢測62
• 5.4 討論62-64
• 5.5 小結(jié)64-65
• 第六章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MAFT基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的初步研究65-74
• 6.1 材料與方法65
• 6.1.1 試驗材料65
• 6.2 試驗方法65-67
• 6.2.1 受體植物材料的準備65
• 6.2.2 培養(yǎng)基中kan有效工作濃度的確定65
• 6.2.3 培養(yǎng)基中抑菌抗生素種類的確定65-66
• 6.2.4 培養(yǎng)基中抑菌抗生素濃度的確定66
• 6.2.5 侵染用農(nóng)桿菌菌液濃度的確定66
• 6.2.6 農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時間的確定66
• 6.2.7 FT基因轉(zhuǎn)化苜蓿及轉(zhuǎn)基因植株鑒定66-67
• 6.3 結(jié)果67-72
• 6.3.1 卡那霉素濃度對愈傷組織形成的影響67-68
• 6.3.2 抑菌抗生素種類對愈傷組織形成的影響68
• 6.3.3 抑菌抗生素濃度對農(nóng)桿菌的抑制作用68-69
• 6.3.4 農(nóng)桿菌菌液濃度對愈傷組織形成的影響69-70
• 6.3.5 共培養(yǎng)時間對愈傷組織生長狀況的影響70
• 6.3.6 目的基因FT對紫花苜蓿的轉(zhuǎn)化70-72
• 6.4 討論72-73
• 6.5 小結(jié)73-74
• 第七章 總結(jié)74-75
• 7.1 結(jié)論74
• 7.2 本研究的創(chuàng)新點74
• 7.3 有待進一步研究的問題74-75
• 參考文獻75-87
• 附錄87-102
• 附錄一 試驗溶液配制87-94
• 附錄二 主要試驗方法94-100
• 附錄三 Q-PCR相關(guān)曲線100-102
• 縮略詞102-103
• 致謝103-104
• 作者簡介104

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本文編號：405450