本文關鍵詞：araf通過不同信號通路的介導調控胚胎早期的胚層形成，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脊椎動物的胚胎在發(fā)育過程中會形成三個具有不同發(fā)育命運的胚層。胚層的分化涉及諸多調控因子和信號通路的精密調節(jié)。Nodal信號和FGF信號對于中內胚層的誘導和背腹體軸的建立具有十分重要的調控作用。這兩條信號通路也相互作用,相互調節(jié)以確保胚胎在發(fā)育過程中具有合適的信號強度。本課題主要研究了araf基因對斑馬魚胚胎早期胚層分化的調控作用,以及在這一過程中araf基因通過其不同異構體調節(jié)Nodal和FGF信號通路的分子機制。本課題首先探究了Araf激酶在斑馬魚胚胎胚層分化中的作用。敲低araf能促進中內胚層的誘導和背部組織的形成。遺傳互作的實驗顯示,過表達全長araf mRNA能拮抗激活的Nodal信號所導致的各胚層標記基因的表達變化。此外,Araf對中內胚層的抑制作用不依賴于其下游Erk的介導。與此同時,一系列在體外細胞系中的生化實驗揭示,Araf通過直接磷酸化Smad2調控Nodal/Smad2信號。至此,本課題發(fā)現(xiàn)了Raf調控Nodal/Smad2信號的一個新途徑。araf基因初級轉錄本通過選擇性多聚腺苷酸化產生異構體—araf tv2,其翻譯產物缺失C-端激酶活性區(qū)。araf tv2的表達量隨著早期胚胎的發(fā)育逐漸升高。過表達araf tv2將導致胚胎的發(fā)育出現(xiàn)異常,并導致中胚層、內胚層和神經外胚層的標記基因出現(xiàn)明顯下調,而使表皮外胚層的標記基因出現(xiàn)明顯上調。進一步的實驗發(fā)現(xiàn),Araf tv2能直接結合全長Araf,但是卻不拮抗全長Araf對TGF-β/Smad2信號的抑制作用。Araf tv2能有效地抑制FGF/MAPK信號,并在胚胎中拮抗過表達FGF配體所導致的下游Erk激活以及相應各胚層標記基因的表達變化。從機制上來看,Araf tv2能與Ras蛋白發(fā)生直接的相互作用,并競爭性地拮抗Ras與Raf蛋白的結合,從而阻礙了Ras-Raf-Mek-Erk通路的信號轉導。在胚胎中過表達araf tv2能有效拮抗過表達激活型Ras所導致的Erk激活以及相應各胚層標記基因的表達變化。最后,Araf tv2對FGF/MAPK信號的抑制作用是依賴于其與Ras蛋白的相互作用。綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)了Ras-Raf-Mek-Erk級聯(lián)反應與Noda/Smad2信號之間相互作用的又一關鍵基因—araf。araf基因通過其不同的異構體分別作用于Nodal/Smad2信號和FGF/MAPK信號通路,參與調控斑馬魚胚胎早期的胚層分化。
【關鍵詞】：araf Nodal/Smad2 FGF/MAPK 斑馬魚 胚層分化
【學位授予單位】：清華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q954.4
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 第1章 引言10-47
• 1.1. 斑馬魚的胚胎發(fā)育過程10-16
• 1.1.1. 斑馬魚作為模式生物的優(yōu)勢11-12
• 1.1.2. 斑馬魚胚胎的發(fā)育過程12-16
• 1.2. 胚胎發(fā)育過程中的圖式形成16-27
• 1.2.1. 胚胎三個胚層的形成與發(fā)育命運17
• 1.2.2. 胚胎中內胚層的誘導17-24
• 1.2.3. 胚胎背腹軸線的建立24-27
• 1.3. Nodal信號通路27-33
• 1.3.1. Nodal通路的信號轉導28-31
• 1.3.2. 調控Nodal信號通路的相關因子31-32
• 1.3.3. Nodal信號在胚胎發(fā)育中的重要作用32-33
• 1.4. 成纖維細胞生長因子（FGF）信號通路33-40
• 1.4.1. FGF家族成員33-34
• 1.4.2. FGF通路的信號轉導34-37
• 1.4.3. 調控FGF信號通路的相關因子37-38
• 1.4.4. FGF信號在胚胎發(fā)育中的重要作用38-40
• 1.5. Raf家族蛋白及其調控40-46
• 1.5.1. Raf蛋白結構及其調控機制40-44
• 1.5.2. Araf蛋白及其研究進展44-46
• 1.6. 本課題的研究目的與意義46-47
• 第2章 材料與方法47-74
• 2.1. 斑馬魚胚胎的獲得與培養(yǎng)條件47
• 2.2. 實驗相關克隆的構建47-51
• 2.2.1. 研究使用的質粒信息47-48
• 2.2.2. 構建克隆的引物信息48-49
• 2.2.3. 質粒的提取與純化49-51
• 2.3. 胚胎顯微注射51-54
• 2.3.1. 體外轉錄合成m RNA51-52
• 2.3.2. 嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸（MO）的設計與使用52-53
• 2.3.3. 胚胎顯微注射方法53-54
• 2.4. 胚胎整胚原位雜交54-58
• 2.4.1. 探針的制備54-55
• 2.4.2. 原位雜交所需材料與試劑55-57
• 2.4.3. 原位雜交方法57-58
• 2.5. 斑馬魚胚胎總RNA提取和半定量PCR58-60
• 2.5.1. 總RNA提取58-59
• 2.5.2. c DNA的制備59-60
• 2.5.3. 半定量PCR60
• 2.6. 實時熒光定量PCR60-61
• 2.7. 胚胎整胚免疫熒光61-63
• 2.7.1. 整胚免疫熒光所用主要試劑61-62
• 2.7.2. 整胚免疫熒光方法62-63
• 2.8. 胚胎免疫印跡63-64
• 2.9. 細胞培養(yǎng)64-68
• 2.9.1. 細胞系的種類與相關試劑64-65
• 2.9.2. 細胞的培養(yǎng)、傳代、凍存與復蘇方法65-66
• 2.9.3. 細胞轉染66-68
• 2.10. 細胞的雙熒光素酶報告基因實驗68-69
• 2.10.1. 細胞選擇與實驗試劑68
• 2.10.2. ARE報告基因實驗方法68-69
• 2.10.3. Elk-1 報告基因實驗方法69
• 2.10.4. 實驗數(shù)據(jù)的分析69
• 2.11. 細胞蛋白檢測的免疫印跡69-72
• 2.11.1. 實驗試劑與材料70
• 2.11.2. 免疫印跡實驗方法70-72
• 2.12. 免疫共沉淀72-74
• 2.12.1. 免疫共沉淀相關試劑與材料72
• 2.12.2. 免疫共沉淀實驗方法72-74
• 第3章 全長Araf拮抗Nodal/Smad2信號介導的中內胚層誘導74-88
• 3.1. 全長Araf激酶抑制中內胚層誘導和背部組織的形成74-79
• 3.1.1. araf基因全長轉錄本的表達譜74-75
• 3.1.2. 敲低araf促進斑馬魚胚胎中內胚層的誘導75-78
• 3.1.3. 過表達全長araf m RNA抑制中內胚層的誘導78-79
• 3.1.4. 小結79
• 3.2. 全長Araf拮抗Nodal/Smad2信號以抑制中內胚層誘導79-84
• 3.2.1. 全長Araf拮抗胚胎中Nodal信號過表達引起的發(fā)育異常80-81
• 3.2.2. 敲低araf部分挽救抑制Nodal導致的發(fā)育缺陷81-83
• 3.2.3. 全長Araf對Nodal信號的拮抗作用不依賴于下游的Erk83-84
• 3.2.4. 小結84
• 3.3. 本章總結及討論84-88
• 第4章 Araftv2拮抗FGF/MAPK信號調控胚胎的胚層分化88-123
• 4.1. Araftv2調控斑馬魚胚胎早期的胚層分化88-92
• 4.1.1. araf tv2在斑馬魚胚胎中的時空表達譜89-91
• 4.1.2. 過表達araf tv2導致胚胎出現(xiàn)發(fā)育異常91-92
• 4.1.3. 小結92
• 4.2. Araftv2不拮抗全長Araf對TGF-β/Smad2信號的抑制作用92-99
• 4.2.1. Araftv2能與Araf tv1蛋白結合93-94
• 4.2.2. Araftv2不拮抗全長Araf對TGF-β/Smad2信號的抑制作用94-98
• 4.2.3. 小結98-99
• 4.3. Araftv2在細胞系中和胚胎中拮抗FGF/MAPK通路99-106
• 4.3.1. Araftv2抑制FGF/MAPK信號活性99-101
• 4.3.2. Araftv2拮抗胚胎中激活的FGF/MAPK信號101-103
• 4.3.3. Araftv2拮抗胚胎中過表達FGF所導致的標記基因改變103-106
• 4.3.4. 小結106
• 4.4. Araftv2通過作用于Ras抑制FGF/MAPK信號活性106-118
• 4.4.1. Araftv2與Ras直接相互作用106-108
• 4.4.2. Araftv2拮抗Ras介導的FGF/MAPK信號活性108-114
• 4.4.3. Araftv2特異地作用于Ras水平來抑制FGF/MAPK信號114-116
• 4.4.4. 小結116-118
• 4.5. Araftv2抑制FGF/MAPK信號依賴于其與Ras的互作118-122
• 4.6. 本章總結及討論122-123
• 第5章 討論與展望123-130
• 5.1. 本課題的結論與模型123-124
• 5.2. Raf蛋白對于中內胚層發(fā)育的調控作用124-125
• 5.3. araf基因表達的調控125-127
• 5.4. Araftv2對TGF-β/Smad2信號的抑制作用127
• 5.5. Araftv2對Ras蛋白的特異作用127-129
• 5.6. 斑馬魚Raf蛋白對FGF信號的轉導129-130
• 參考文獻130-144
• 致謝144-146
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果146

  本文關鍵詞：araf通過不同信號通路的介導調控胚胎早期的胚層形成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：405412