本文關鍵詞：MAPK途徑在OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中血管再生相關基因表達變化中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展,目前,骨科臨床治療水平有了長足進步,很多骨科疾病可以治愈,但是某些疾病,如骨折不愈合、骨質(zhì)疏松癥、股骨頭壞死、骨缺損,仍然需要找到新的治療手段,以期進一步提高臨床治療水平。骨髓間充質(zhì)干細胞的發(fā)現(xiàn)和應用,為臨床提供新的思路。骨折部位血管再生是骨痂形成的前提,在血管再生過程中,血管再生相關基因起重要的作用;骨痂的形成還需要骨痂形成的種子細胞,即成骨細胞,骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化是成骨細胞的主要來源,目前骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化已取得很大進展,活化的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑參與骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化過程。成骨生長肽(OGP)是一種成骨生長因子,近十年研究較多,通過研究成骨生長肽誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中血管再生相關基因Angptl4、Fbln5、VEGFA表達變化與MAPK途徑的關系,闡明OGP促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化的機理,為臨床應用OGP治療骨質(zhì)疏松癥及及促進骨折愈合奠定理論基礎。共包括四個實驗:實驗一,大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng),通過該實驗掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離和培養(yǎng)的條件;實驗二,OGP誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化,通過這一實驗,驗證OGP對骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨誘導作用,并找到OGP成骨誘導作用的最佳濃度;實驗三,胎牛血清對成骨生長肽促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖分化的影響,通過這一實驗,找到最佳的胎牛血清濃度;實驗四,MAPK途徑血在OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中血管再生相關基因表達變化中的作用,通過這個實驗,觀察在OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中血管再生相關基因(Angptl4、Fbln5、VEGF)表達變化和MAPK途徑的關系。方法:實驗一:采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。實驗二:將實驗一中P3代骨髓多能干細胞,分為六組:即對照組、10-10mol/LOGP組、10-9mol/LOGP組、10-8mol/L OGP組、10-7mol/L OGP組。對照組使用不含血清的DEEM培養(yǎng)基,各種濃度的OGP組在不含血清的DEEM培養(yǎng)基中加入相應濃度的OGP。連續(xù)培養(yǎng)12天。用倒置相差顯微鏡觀察成骨細胞形態(tài),鈣鈷法堿性磷酸酶染色,鈣結節(jié)茜素紅染色進行成骨細胞鑒定。MTT檢測各組光吸收度值(OD值),觀察各組間OD值差異。實驗三:MTT噻唑藍比色法測定不同條件下BMSCs的增殖:取第二代以后形狀典型的BMSCs以1×105/m L的密度用含10%FBS的完全培養(yǎng)基分別接種于6塊無菌96孔板中,細胞周期同步開始進行后續(xù)分組實驗。每塊板承載六組,分別為OGP10-10mol/L組、OGP10-9mol/L組、OGP10-8mol/L組和不加任何藥物的對照組,每組細胞同時設FBS濃度為0、2%、5%、8%和10%五個梯度,每組三個復孔,每3d換液一次。1d、3d、5d、7d、9d、12d采用MTT法檢測細胞的增殖率。每孔直接加入10u L的MTT,放回培養(yǎng)箱中原條件孵育4h。之后棄去上清,每孔加入100u L的10%的SDS,37℃過夜培養(yǎng)。酶標儀檢測各孔570nm吸光度,記錄分析各組光吸收值。p NPP法測定細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性:將第二代以后形狀典型的BMSCs以1×105/ml的密度接種于六孔板中,細胞完全貼壁后,將培養(yǎng)液換成不含血清的基礎培養(yǎng)基,培養(yǎng)12h,此時細胞周期同步。開始進行后續(xù)分組實驗。實驗組為:OGP10-10mol/L組、OGP10-9mol/L組和OGP10-8mol/L組,未加OGP的為對照組,每組細胞同時設FBS濃度含量5%、8%和10%三個梯度,各組細胞均設6個復孔,每3d換液一次,在第9d刮取細胞,4000rpm/min離心收集到1.5m L的離心管中進行堿性磷酸酶活性檢測。觀察各組差異。實驗四:將P3代骨髓多能干細胞,分為:(1)對照組(OGP誘導)組;(2)OGP+U0126組;(3)OGP+SP600125組;(4)OGP+SB203580組;(5)OGP+U0126+SP600125+SB203580組,共5組,各分組在無血清的DEEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時,待細胞周期同期化后,2至4組分別加入相應濃度的不同MAPK通路抑制劑,5組加入2至4組所用各通路抑制劑濃度預處理30分鐘后,然后加入10-8mol/L OGP,培養(yǎng)板置于370C,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)3天。同時取各組上清液和細胞進行指標檢測。RT-PCR檢測c-myc、c-jun、atf-2、Angptl4、Fbln5、VEGF、Cbfa1m RNA的表達,western-blot(蛋白印跡法)檢測Angptl4、Fbln5、VEGF的表達,觀察表達量的差異。結果實驗一在倒置顯微鏡下,剛剛分離取到的骨髓間充質(zhì)干細胞細胞形態(tài)比較均勻一致,多為圓形,細胞體透亮,大小不一,混雜有其他雜細胞,24h半量換液后,可見細胞貼壁,呈圓形或多角形,48h后全量換液時,可見大量細胞貼壁,72h后貼壁細胞繼續(xù)增加,細胞形態(tài)逐漸均一,呈短梭形,隨著時間延長,細胞呈梭形或紡錘形,逐漸融合成片,呈漩渦狀分布。具有典型的骨髓間充質(zhì)干細胞的特點。實驗二倒置相差顯微鏡下細胞的形態(tài)呈梭形或紡錘形,呈現(xiàn)成纖維細胞的形態(tài),分布均勻。細胞融合成片,可呈鋪路石樣變化,具有典型的成骨細胞形態(tài),鈷法堿性磷酸酶染色可見黑色顆粒,鈣結節(jié)茜素紅染色橙紅色,證明培養(yǎng)的細胞為成骨細胞。MTT檢測示培養(yǎng)基中OGP的濃度在10-8mmol/l,培養(yǎng)12天時,光吸收度值最高。實驗三MTT檢測表明,FBS濃度越低,細胞增殖越慢。當FBS濃度為0時培養(yǎng)液加入OGP僅能短時微弱促進BMSCs增殖。當FBS濃度為2%時培養(yǎng)液加入OGP顯示10-8mol/L組與其它組相比明顯但是短暫促進BMSCs增殖,但是最終由于細胞缺乏營養(yǎng)因子生長進入平臺期并且開始凋亡。當FBS濃度為5%時各組細胞均出現(xiàn)增殖,并且以OGP10-8mol/L組促增殖效果明顯大于OGP10-9mol/L組(P0.05),隨著培養(yǎng)時間延長至9d,部分細胞增殖減慢。當FBS濃度為8%時各組細胞增殖差異更加明顯(P0.01),OGP10-8mol/L組促增殖效果依然大于OGP10-9mol/L組,對照組和OGP10-10mol/L組無差異(P0.05)。當FBS濃度為10%時OGP10-10mol/L組促增殖效果低于對照組,OGP10-9mol/L組和OGP10-8mol/L組差異縮小,其差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),OGP10-8mol/L組不再表現(xiàn)其促增殖的優(yōu)勢。堿性磷酸酶活性結果顯示:三種FBS濃度的對照組之間相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明隨著培養(yǎng)系統(tǒng)中血清含量的增加,ALP的產(chǎn)生也相應變化,FBS濃度可以影響B(tài)MSCs的成骨分化。各組OGP濃度隨著FBS濃度的增大ALP的產(chǎn)量也顯著增加(P0.05),說明FBS通過誘導BMSCs增殖從而增加了成骨分化的細胞數(shù)量。值得關注的是8%FBS濃度組OGP10-8mol/L組顯著高于OGP10-9mol/L組,但是10%FBS濃度組OGP10-8mol/L組與OGP10-9mol/L組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明10%FBS干擾了OGP的促分化作用。綜上所述:我們認為8%FBS的培養(yǎng)條件比較有利于檢測OGP誘導BMSCs的增殖和成骨分化,為后續(xù)進一步探討OGP誘導BMSCs的增殖和成骨分化的信號機制奠定了科學合理的培養(yǎng)條件。實驗四MAPK的主要通路ERK1/2、JNK、P38信號傳導通路均參與OGP促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程。Angptl4、Fbln5、VEGFA在OGP促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程均有表達。c-myc在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的0天、1天、3天、5天、7天均表達;c-jun在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的0天、1天、3天、5天、7天、9天均表達;atf-2在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的7天、9天表達;VEGF在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的1天、3天、5天均表達;Fbln5在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的第7天表達;Angptl4在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的1天、3天、5天、7天均表達;Cbfa1在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的0天、1天、3天、5天、7天、9天均未見表達。因而加抑制劑各組選擇在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導第7天檢測c-jun、c-myc、atf-2;選擇在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導第5天檢測VEGF、Angptl4。第2組(10-8mol/LOGP+U組)不表達c-myc,說明ERK1/2通路參與OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程;第3組(10-8mol/LOGP+SP)組不表達c-jun,說明JNK通路參與OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程;第4組(10-8mol/L OGP+SB)組不表達atf-2,說明P38通路參與OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程;各組均表達VEGF,但是第3組表達量比對照組增加,第2組、第5組表達量比對照組下降,這說明ERK1/2途徑參與骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程,不僅該途徑參與VEGF的表達,還有其他途徑參加;各組均表達Fbln5,但是第4組和第5組表達量比對照組下降,這說明P38通路參與OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程,該通路參與Fbln5的表達;各組均表達Angptl4,但是第3組和第5組表達量比對照組下降,說明JNK通路參與OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程,該通路參與Angptl4的表達;western-blot檢測結果證實隨著VEGF、Angptl4、Fbln5m RNA表達的變化,VEGF、Angptl4、Fbln5蛋白相應變化。結論1、OGP濃度選擇10-8mmol/L、8%FBS的培養(yǎng)條件比較有利于OGP誘導BMSCs的增殖和成骨分化。2、MAPK信號傳導通路的主要通路:ERK1/2、P38、JNK通路參與OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程;P38通路參與OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程,該通路參與Fbln5的表達;JNK通路參與OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程,該通路參與Angptl4的表達;ERK1/2途徑參與骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程,不僅該途徑參與VEGF的表達,還有其他途徑參加;western-blot檢測結果證實隨著VEGF、Angptl4、Fbln5m RNA表達的變化,VEGF、Angptl4、Fbln5蛋白相應變化。說明:MAPK信號傳導途徑參與OGP誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化,并參與成骨分化過程中血管再生相關基因Angptl4、Fbln5、VEGF表達變化。
【關鍵詞】：成骨生長肽(OGP) 骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs) 血管再生基因 MAPK途徑
【學位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 提要3-8
• ABSTRACT8-16
• 引言16-17
• 實驗一 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng)17-21
• 1.材料17
• 2.實驗方法17
• 3.代以后的細胞備用17-18
• 4.討論18-19
• 參考文獻19-21
• 實驗二 OGP誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化21-28
• 1.材料21
• 2.實驗試劑21
• 3.實驗儀器21-22
• 4.成骨細胞的培養(yǎng)22
• 5.成骨細胞的形態(tài)學觀察22
• 6.成骨細胞的鑒定22-24
• 6.1 堿性磷酸酶檢測22-23
• 6.2 礦化結節(jié)茜素染色觀察23-24
• 6.3 不同濃度OGP對成骨細胞增殖率的MTT檢測24
• 7.統(tǒng)計學方法24
• 8.結果24-25
• 8.1 倒置顯微鏡觀察成骨細胞形態(tài)24
• 8.2 成骨細胞鑒定結果24-25
• 8.3 成骨細胞增殖率的MTT檢測結果25
• 9.討論25-27
• 參考文獻27-28
• 實驗三 胎牛血清對成骨生長肽促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖分化的影響28-37
• 1 實驗動物和主要試劑28
• 2 儀器設備28-29
• 3 方法29-30
• 3.1 骨髓間充質(zhì)原代細胞的分離培養(yǎng)和誘導分化29
• 3.2 MTT噻唑藍比色法測定不同條件下BMSCs的增殖29
• 3.3 pNPP法測定細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性29-30
• 4.統(tǒng)計學分析30
• 5.結果30-33
• 5.1 BMSCs的形態(tài)觀察30-31
• 5.2 MTT檢測不同F(xiàn)BS濃度對三種OGP濃度促進BMSCs增殖的影響31-32
• 5.3 細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性檢測結果32-33
• 6.討論33-35
• 參考文獻35-37
• 實驗四 MAPK途徑在OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中血管再生相關基因表達變化中的作用37-54
• 1 材料37-38
• 1.1 動物4周齡SD雄性大鼠，體重 160g左右，購自山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心37
• 1.2 主要儀器37-38
• 1.3 主要試劑DMEM(Invitrogen corporation)38
• 1.4 分組對照組(OGP誘導)組；OGP+ U0126組38
• 2 方法38
• 2.1 原代BMSCs的分離和培養(yǎng)38
• 2.2 分組38
• 2.3 BMSCs的成骨分化38
• 3 RT-PCR檢測c-myc、c-jun、atf-2、Angptl4、Fbln5、VEGFA、Cbfa1mRNA的表達38-41
• 4 Western-blot（蛋白質(zhì)印跡分析）檢測Angptl4、Fbln5、VEGFA的表達41-42
• 5 統(tǒng)計學處理方法42
• 6 結果42-50
• 7 討論50-54
• 結論54-55
• 參考文獻55-57
• 綜述57-66
• 綜述一57-62
• 參考文獻60-62
• 綜述二62-66
• 參考文獻63-66
• 主要符號表66-67
• 致謝67-68
• 查新報告68-76
• 發(fā)表論文76-89
• 詳細摘要89-94

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 彭濤;黃姣;徐凌;;成骨生長肽促進鈦表面大鼠成骨細胞的增殖分化[J];中國組織工程研究;2012年34期

  本文關鍵詞：MAPK途徑在OGP誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中血管再生相關基因表達變化中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：392708