2015-2016年,寨卡病毒在全球范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)流行,暴露出該病毒感染與特定神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生率增加有關(guān),比如先天性寨卡綜合征(含小頭癥)和成人格林-巴利綜合征。然而,造成寨卡病毒神經(jīng)感染性增強(qiáng)的因素仍然不確定。我們假設(shè),寨卡病毒在感染神經(jīng)系統(tǒng)時(shí),部分病毒基因組發(fā)生適應(yīng)性突變,可能增強(qiáng)了病毒對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的感染性。由于寨卡病毒可以感染野生型新生小鼠,并可導(dǎo)致類似小頭癥、癱瘓和癲癇發(fā)作的神經(jīng)性疾病;而這些神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)與新生小鼠神經(jīng)元祖細(xì)胞和其他神經(jīng)細(xì)胞的寨卡感染有關(guān),所以,我們認(rèn)為新生乳鼠可以作為研究寨卡病毒遺傳特征如何對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生影響的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀榱蓑?yàn)證假設(shè),我們?cè)谛律槭蟠竽X中將寨卡病毒2016年臨床分離株SW01連續(xù)傳播11代,獲得了適應(yīng)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的寨卡病毒MA-SW01,并發(fā)現(xiàn)該病毒在體內(nèi)的神經(jīng)毒性和復(fù)制能力顯著增強(qiáng),且主要靶向區(qū)域?yàn)榇竽X皮層和海馬區(qū)。通過(guò)高通量測(cè)序,我們發(fā)現(xiàn)MA-SW01全基因組上有4個(gè)大于80%的高頻錯(cuò)義突變,這些突變導(dǎo)致3個(gè)E蛋白氨基酸突變(D67N,M68I,N154D)和1個(gè)NS2A蛋白氨基酸突變(A117T)。進(jìn)一步病毒反...

【文章頁(yè)數(shù)】：105 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一章 引言
    1.1 寨卡病毒概述
        1.1.1 寨卡病毒的傳播途徑和流行病學(xué)
        1.1.2 寨卡病毒的基因組與分類
        1.1.3 寨卡病毒的結(jié)構(gòu)
        1.1.4 寨卡病毒的生命周期
        1.1.5 寨卡病毒感染后的臨床癥狀
    1.2 寨卡病毒基因突變與其感染性的關(guān)系
    1.3 寨卡病毒神經(jīng)毒性的研究
        1.3.1 PrM蛋白進(jìn)化突變論
        1.3.2 E蛋白糖基化修飾論
        1.3.3 非結(jié)構(gòu)蛋白作用論
        1.3.4 ADE效應(yīng)論
    1.4 利用小鼠進(jìn)行寨卡病毒適應(yīng)性進(jìn)化研究的可行性
    1.5 寨卡病毒反向遺傳學(xué)研究
    1.6 研究寨卡病毒病理學(xué)的小鼠模型
        1.6.1 免疫缺陷成年小鼠模型
        1.6.2 免疫健全成年小鼠模型
        1.6.3 胎鼠和新生乳鼠模型
第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 寨卡病毒的體外擴(kuò)增繁殖
        2.3.2 寨卡病毒在乳鼠顱內(nèi)的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        2.3.3 寨卡病毒在乳鼠體內(nèi)的接種傳代
        2.3.4 寨卡病毒滴度的測(cè)定
        2.3.5 寨卡病毒小鼠毒力測(cè)試
        2.3.6 組織器官RNA提取方法
        2.3.7 組織器官中病毒載量的測(cè)定
            2.3.7.1 cDNA合成
            2.3.7.2 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)
        2.3.8 免疫熒光檢測(cè)腦組織病毒感染
        2.3.9 寨卡病毒高通量測(cè)序與分析
        2.3.10 單克隆病毒的挑選與擴(kuò)增
        2.3.11 單克隆病毒E蛋白核酸序列的測(cè)定
        2.3.12 反向遺傳學(xué)構(gòu)建定點(diǎn)突變寨卡病毒
        2.3.13 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞感染
        2.3.14 病毒遺傳穩(wěn)定性體外檢測(cè)
        2.3.15 寨卡病毒和登革熱病毒E蛋白序列的多重比較
        2.3.16 寨卡病毒糖基化檢測(cè)
        2.3.17 流式細(xì)胞技術(shù)定量感染細(xì)胞
        2.3.18 統(tǒng)計(jì)分析方法
    2.4 倫理聲明
第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 建立寨卡病毒感染乳鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒傳代模型
    3.2 小鼠CNS適應(yīng)性寨卡病毒MA-SW01 展現(xiàn)出病毒毒力增強(qiáng)特征
    3.3 MA-SW01 可以在乳鼠大腦中建立復(fù)制優(yōu)勢(shì)
    3.4 MA-SW01 的主要靶向區(qū)域是大腦的海馬區(qū)和皮層區(qū)
    3.5 從MA-SW01 病毒株分離出的單克隆病毒即具有毒力增強(qiáng)的表型
    3.6 高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)MA-SW01 產(chǎn)生4 個(gè)高頻錯(cuò)義突變
    3.7 構(gòu)建含E蛋白突變和NS2A突變的感染性克隆病毒
    3.8 E蛋白67-68 位的連續(xù)突變對(duì)病毒毒力增強(qiáng)至關(guān)重要
    3.9 測(cè)序分析顯示E蛋白67 位點(diǎn)是潛在的毒力決定位點(diǎn)
    3.10 E蛋白67 位點(diǎn)是病毒毒力增強(qiáng)決定位點(diǎn)
    3.11 E蛋白68 位點(diǎn)突變對(duì)維持病毒67 位點(diǎn)突變穩(wěn)定性不是必要條件
    3.12 E蛋白67 位點(diǎn)突變沒(méi)有形成經(jīng)典的糖基化功能
    3.13 E蛋白67 位點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)了病毒在乳鼠大腦中的復(fù)制能力
    3.14 E蛋白67 位點(diǎn)的替代突變可能是病毒在CNS的適應(yīng)性結(jié)果
第四章 總結(jié)與討論
    4.1 課題結(jié)論與潛在意義
    4.2 課題設(shè)計(jì)的不足之處
    4.3 課題研究的重點(diǎn)展望
參考文獻(xiàn)
略縮語(yǔ)
作者簡(jiǎn)歷
代表性文章
專業(yè)綜述
    References
致謝



本文編號(hào)：3860189