發(fā)布時間：2023-08-26 00:07

　　蛋白合成在細胞的生長、繁殖和生存過程中起著至關重要的作用。細胞內的蛋白合成過程受到嚴格的調控。蛋白翻譯失調被認為是腫瘤的特征之一。蛋白翻譯起始是整個蛋白合成的限速步驟,而eIF4F復合物參與的43S復合物的裝配是蛋白翻譯起始的限速步驟,所以eIF4F復合物的調控對于整個蛋白翻譯的效率的調節(jié)起著重要的作用,因此eIF4F復合物通常被作為腫瘤治療的藥物靶點。eIF4F復合物主要由eIF4A、eIF4E和eIF4G組成,其中eIF4E的調控機制及藥物靶點研究較為成熟,而eIF4A和eIF4G的調控機制有待進一步被闡明。O-GlcNAc糖基化修飾是通過β-D-N-乙酰葡糖胺共價連接到蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸羥基上的一種細胞內蛋白翻譯后修飾。目前已發(fā)現鑒定1000多種具有O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白,越來越多的證據表明,O-GlcNAc糖基化修飾調節(jié)各種重要的生物學過程,包括轉錄、干細胞分化、信號轉導、細胞周期進程和代謝重編程等。O-GlcNAc糖基化紊亂能夠導致II型糖尿病、神經退化性疾病、阿爾茲海默氏病、腫瘤等多種重大疾病的發(fā)生。過去幾年的研究表明O-GlcNAc糖基化修飾能夠直接或間接調...

【文章頁數】：126 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
縮寫對照表
第一章 綜述
    1.1 蛋白翻譯起始概述
        1.1.1 蛋白質生物合成
        1.1.2 蛋白翻譯起始
        1.1.3 蛋白翻譯起始因子
        1.1.4 eIF4F復合物
        1.1.5 eIF4F復合物的調控
        1.1.6 eIF4F復合物的失調與腫瘤
        1.1.7 eIF4F復合物可作為腫瘤治療的靶點
    1.2 O-GlcNAc糖基化修飾概述
        1.2.1 HBP途徑與營養(yǎng)感受器
        1.2.2 OGA與 OGT
        1.2.3 O-GlcNAc糖基化修飾與腫瘤
        1.2.4 O-GlcNAc糖基化修飾作為腫瘤治療的靶點
立題依據和意義
第二章 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾調控蛋白合成機制
    2.1 材料與方法
        2.1.1 核酸序列
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 主要緩沖液配方
        2.1.4 細胞培養(yǎng)與腫瘤組織
        2.1.5 表達質粒的構建
        2.1.6 eIF4G1和e IF4A基因突變表達載體的構建
        2.1.7 shRNA載體的構建
        2.1.8 去內毒素質粒的提取
        2.1.9 細胞轉染
        2.1.10 慢病毒的制備及細胞感染
        2.1.11 蛋白表達與純化
        2.1.12 Western Blot
        2.1.13 O-GlcNAc糖基化修飾的檢測
        2.1.14 細胞內蛋白合成測定
        2.1.15 體外蛋白合成測定
        2.1.16 多核糖體檢測實驗
        2.1.17 eIF4AI的解螺旋酶活性測定
        2.1.18 m7GDP親和層析實驗
        2.1.19 細胞增殖實驗
        2.1.20 軟瓊脂細胞克隆形成實驗
        2.1.21 裸鼠移植瘤形成實驗
        2.1.22 數據統(tǒng)計分析
    2.2 結果與分析
        2.2.1 OGT能與細胞內的e IF4F復合物相互作用
        2.2.2 eIF4F復合物中的e IF4AI和 eIF4GI存在O-GlcNAc糖基化修飾
        2.2.3 eIF4AI是在細胞蛋白翻譯過程中發(fā)揮主要功能的eIF4A基因剪接體
        2.2.4 eIF4AI的糖基化修飾受細胞內的營養(yǎng)狀態(tài)動態(tài)調控
        2.2.5 腫瘤細胞中的eIF4AI的糖基化水平降低
        2.2.6 eIF4AI的絲氨酸322 位和323 位是主要的O-GlcNAc糖基化位點
        2.2.7 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾干擾了eIF4F復合物的裝配
        2.2.8 提高e IF4AI的 O-GlcNAc糖基化抑制了eIF4AI與 eIF4GI的互作
        2.2.9 細胞內的營養(yǎng)狀態(tài)影響了eIF4AI與 eIF4GI的互作
        2.2.10 細胞內的營養(yǎng)狀態(tài)影響了eIF4AI與內源的eIF4GI的互作
        2.2.11 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制了其解旋酶活性
        2.2.12 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制體外的蛋白合成效率
        2.2.13 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制了細胞內的蛋白合成效率
        2.2.14 構建穩(wěn)定的WT、S322/S323A和 S322/S323Y的eIF4AI補救的A2780 細胞系
        2.2.15 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制了卵巢癌細胞的繁殖
        2.2.16 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制了裸鼠中卵巢癌細胞的成瘤
        2.2.17 卵巢癌組織樣品中的OGT、OGA含量和總體的O-GlcNAc糖基化修飾檢測
        2.2.18 卵巢癌組織樣品中的eIF4AI的糖基化水平下調
    2.3 小結
第三章 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾調控蛋白合成機制
    3.1 材料與方法
        3.1.1 核酸序列
        3.1.2 主要試劑和儀器
        3.1.3 細胞培養(yǎng)與腫瘤組織
        3.1.4 CRISPR-Cas9介導的基因敲入
        3.1.5 熒光各向異性實驗
        3.1.6 可剪切的蛋白交聯實驗
        3.1.7 細胞周期同步化和流式檢測
        3.1.8 免疫共沉淀實驗
        3.1.9 MCF-7 細胞裸鼠移植瘤形成實驗
    3.2 結果與分析
        3.2.1 eIF4GI是在細胞蛋白翻譯過程中發(fā)揮主要功能的剪接體
        3.2.2 eIF4GI的糖基化修飾受細胞內的營養(yǎng)狀態(tài)動態(tài)調控
        3.2.3 腫瘤細胞中e IF4GI的糖基化水平呈現升高趨勢
        3.2.4 S61是e IF4GI的主要O-GlcNAc糖基化修飾位點
        3.2.5 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進了eIF4GI與內源PABP的相互作用
        3.3.6 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾缺失抑制了eIF4GI與 PABP的相互作用
        3.3.7 高糖條件培養(yǎng)促進了內源的eIF4GI與 PABP的相互作用
        3.2.8 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進了eIF4GI與 m RNA的相互作用
        3.2.9 產生e IF4GI S61A突變的MCF-7 細胞系
        3.2.10 MCF-7 細胞中經TMG處理后eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化水平變化
        3.2.11 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進了MCF-7 細胞內源eIF4GI與 PABP的相互作用
        3.2.12 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進了乳腺癌細胞的蛋白合成
        3.2.13 eIF4GI的 S61 位糖基化缺失抑制了多聚核糖體的形成
        3.2.14 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進了乳腺癌細胞的生長
        3.2.15 eIF4GI的 S61 位糖基化缺失抑制了細胞的單克隆形成能力
        3.2.16 eIF4GI的 S61 位糖基化修飾促進了乳腺癌細胞的腫瘤形成能力
        3.2.17 乳腺癌組織樣品中的OGT的含量和總體的O-GlcNAc糖基化修飾檢測
        3.2.18 在乳腺癌組織中e IF4GI的糖基化水平升高
        3.2.19 在細胞周期進程中,eIF4AI和 eIF4GI的糖基化修飾存在動態(tài)變化
    3.3 小結
第四章 總結與討論
    4.1 總結
    4.2 討論
    4.3 創(chuàng)新點
參考文獻
個人簡介



本文編號：3843563