線粒體是形態(tài)學(xué)上高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器,它會(huì)形成管網(wǎng)狀的線粒體網(wǎng)絡(luò)。線粒體網(wǎng)絡(luò)的形成對(duì)于線粒體維持其DNA的完整性,以及線粒體內(nèi)容物的互相交換至關(guān)重要。破壞線粒體網(wǎng)絡(luò)的形成影響線粒體呼吸等諸多功能。研究表明,線粒體網(wǎng)絡(luò)的形成是依賴于單個(gè)線粒體之間的互相融合。在本文的工作中,我們發(fā)現(xiàn)了一種新的線粒體動(dòng)態(tài)行為,命名為“線粒體動(dòng)態(tài)管化”,并揭示了線粒體動(dòng)態(tài)管化是線粒體形成網(wǎng)絡(luò)的重要補(bǔ)充機(jī)制。我們?cè)贜RK細(xì)胞中將KIF5B敲除之后,線粒體網(wǎng)絡(luò)會(huì)聚集在核周,細(xì)胞外圍完全沒(méi)有線粒體分布。當(dāng)在該細(xì)胞中以誘導(dǎo)表達(dá)的方式放回KIF5B之后,KIF5B可以介導(dǎo)發(fā)生動(dòng)態(tài)管化,向外拉出細(xì)長(zhǎng)的線粒體細(xì)管,這些線粒體細(xì)管通過(guò)Mitofusin介導(dǎo)而互相融合,不停重復(fù)這個(gè)過(guò)程使線粒體網(wǎng)絡(luò)的邊界不斷向外延展并最終占滿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。我們使用純化的線粒體、KIF5B蛋白和體外聚合的微管在體外重構(gòu)了線粒體動(dòng)態(tài)管化過(guò)程和體外線粒體網(wǎng)絡(luò),并使用該系統(tǒng)證明了KIF5B介導(dǎo)的線粒體動(dòng)態(tài)管化和Mitofusin介導(dǎo)的線粒體融合一起促使了體外線粒體網(wǎng)絡(luò)的形成。有趣的是KIF5B只調(diào)控細(xì)胞外圍的線粒體網(wǎng)絡(luò)形成,這表明存在其他機(jī)制負(fù)責(zé)核周的線粒體...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要符號(hào)對(duì)照表
第1章 引言
    1.1 線粒體網(wǎng)絡(luò)形成
        1.1.1 線粒體在形態(tài)學(xué)上的高度動(dòng)態(tài)性
        1.1.2 線粒體網(wǎng)絡(luò)形成
    1.2 線粒體融合
        1.2.1 線粒體外膜融合蛋白Mitofusin 1 和Mitofusin 2
        1.2.2 內(nèi)膜融合蛋白OPA1
        1.2.3 線粒體融合的分子機(jī)制
    1.3 線粒體分裂
        1.3.1 線粒體分裂核心蛋白Drp1
        1.3.2 Drp1受體Fis1
        1.3.3 Drp1受體Mff
        1.3.4 MiD49和MiD51
    1.4 線粒體運(yùn)動(dòng)
        1.4.1 線粒體運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)器
        1.4.2 正向運(yùn)輸馬達(dá)蛋白
        1.4.3 馬達(dá)蛋白適配器蛋白
        1.4.4 逆向運(yùn)輸馬達(dá)蛋白
        1.4.5 馬達(dá)蛋白之間的相互影響
        1.4.6 線粒體短程運(yùn)動(dòng)
        1.4.7 線粒體駐停
    1.5 線粒體動(dòng)態(tài)變化的生理意義
        1.5.1 內(nèi)容物混合
        1.5.2 線粒體DNA穩(wěn)定性
        1.5.3 呼吸功能
        1.5.4 線粒體分裂促進(jìn)細(xì)胞凋亡
        1.5.5 對(duì)細(xì)胞壓力的適應(yīng)
    1.6 線粒體動(dòng)態(tài)變化與人類疾病
        1.6.1 常染色體顯性視神經(jīng)萎縮（ DOA）
        1.6.2 2A型腓骨肌萎縮（ CMT2A）
        1.6.3 新生兒致死
    1.7 特殊的細(xì)胞器膜形變：管化
    1.8 本論文研究的目的和意義
第2章 材料與方法
    2.1 抗體、質(zhì)粒與試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 NRK細(xì)胞mRNA提取和cDNA制備
        2.3.1 mRNA提取
        2.3.2 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA
    2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和電轉(zhuǎn)
        2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.4.2 細(xì)胞電轉(zhuǎn)
    2.5 TOM20-GFP和Mito-YFP穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建
    2.6 構(gòu)建KIF5B敲除的NRK細(xì)胞系
        2.6.1 引物設(shè)計(jì)
        2.6.2 引物退火
        2.6.3 酶切酶連
        2.6.4 轉(zhuǎn)化和測(cè)序
        2.6.5 轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞
        2.6.6 初步檢測(cè)
        2.6.7 單克隆檢測(cè)
    2.7 構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)型KIF5B表達(dá)細(xì)胞系
    2.8 線粒體提取
    2.9 蛋白表達(dá)、純化和標(biāo)記
        2.9.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.9.2 藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆
        2.9.3 制備第一代病毒
        2.9.4 制備第二代病毒
        2.9.5 感染昆蟲細(xì)胞
        2.9.6 蛋白提取
        2.9.7 蛋白標(biāo)記
    2.10 體外實(shí)驗(yàn)小室的制作
        2.10.1 凈化清洗缸
        2.10.2 清洗玻片
        2.10.4 小室制作
        2.10.5 質(zhì)量檢測(cè)
    2.11 免疫熒光染色
    2.12 細(xì)胞分級(jí)分離實(shí)驗(yàn)
    2.13 蛋白免疫印跡
    2.14 微管滑行實(shí)驗(yàn)
    2.15 體外重構(gòu)線粒體管化過(guò)程
    2.16 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
    2.17 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡
第3章 線粒體動(dòng)態(tài)管化的發(fā)現(xiàn)
    3.1 本章引論
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.1 線粒體細(xì)絲
        3.2.2 線粒體動(dòng)態(tài)管化的發(fā)現(xiàn)
        3.2.3 線粒體動(dòng)態(tài)管化的性質(zhì)和特點(diǎn)
        3.2.4 線粒體動(dòng)態(tài)管化的普遍性
        3.2.5 線粒體動(dòng)態(tài)管化沿著微管發(fā)生
        3.2.6 線粒體動(dòng)態(tài)管化介導(dǎo)線粒體融合
    3.3 本章小結(jié)
第4章 KIF5B敲除和誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)
    4.1 本章引論
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.2.1 構(gòu)建KIF5B敲除的NRK細(xì)胞系
        4.2.2 構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)型KIF5B表達(dá)細(xì)胞系
    4.3 本章小結(jié)
第5章 KIF5B通過(guò)多步驟介導(dǎo)細(xì)胞外圍線粒體網(wǎng)絡(luò)形成
    5.1 本章引論
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.2.1 KIF5B分三步介導(dǎo)細(xì)胞外圍線粒體網(wǎng)絡(luò)形成
        5.2.2 KIF5B表達(dá)引起線粒體向細(xì)胞外圍方向高頻動(dòng)態(tài)管化
        5.2.3 融合致使線粒體細(xì)管直徑增加和穩(wěn)定
        5.2.4 動(dòng)態(tài)管化不斷擴(kuò)張線粒體網(wǎng)格
        5.2.5 已形成的網(wǎng)格處在高度動(dòng)態(tài)變化中
    5.3 本章小結(jié)
第6章 KIF5B與線粒體相互作用
    6.1 本章引論
    6.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.2.1 KIF5B與線粒體在體內(nèi)共定位
        6.2.2 KIF5B和線粒體在體外相互作用
    6.3 本章小結(jié)
第7章搭建體外線粒體管化系統(tǒng)
    7.1 本章引論
    7.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        7.2.1 體外重構(gòu)系統(tǒng)的搭建
        7.2.2 體外重構(gòu)線粒體動(dòng)態(tài)管化
        7.2.3 體外線粒體動(dòng)態(tài)管化沿著微管發(fā)生
    7.3 本章小結(jié)
第8章 KIF5B在體外系統(tǒng)中介導(dǎo)線粒體網(wǎng)絡(luò)形成
    8.1 本章引論
    8.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        8.2.1 KIF5B介導(dǎo)線粒體在體外形成網(wǎng)絡(luò)
        8.2.2 KI5B介導(dǎo)體內(nèi)和體外線粒體網(wǎng)絡(luò)形成的過(guò)程高度相似
    8.3 本章小結(jié)
第9章 KIF5B介導(dǎo)線粒體網(wǎng)絡(luò)形成需要Mitofusins
    9.1 本章引論
    9.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        9.2.1 GTP促使線粒體在體外形成超級(jí)網(wǎng)絡(luò)
        9.2.2 Mitofusins缺失不影響動(dòng)態(tài)管化但線粒體不能形成網(wǎng)絡(luò)
        9.2.3 Mitofusins缺失的線粒體在體外不能形成線粒體網(wǎng)絡(luò)
    9.3 本章小結(jié)
第10章 討論與展望
    10.1 論文工作總結(jié)與討論
    10.2 展望
        10.2.1 線粒體直徑調(diào)控和分叉形成
        10.2.2 線粒體形態(tài)與功能之間的關(guān)系
        10.2.3 細(xì)胞內(nèi)圈線粒體網(wǎng)絡(luò)的形成機(jī)制
        10.2.4 線粒體動(dòng)態(tài)管化參與線粒體分裂
        10.2.5 線粒體動(dòng)態(tài)管化與MDV形成
        10.2.6 線粒體之間信號(hào)通訊和物質(zhì)交換
        10.2.7 線粒體動(dòng)態(tài)管化和線粒體融合之間的反饋機(jī)制
        10.2.8 線粒體體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用前景
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號(hào)：3809901