發(fā)布時(shí)間：2017-05-19 15:05

  本文關(guān)鍵詞：小鼠磨牙間充質(zhì)成牙潛能的關(guān)鍵分子，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小鼠磨牙是研究哺乳動(dòng)物上皮與間充質(zhì)之間相互作用機(jī)制的重要模型。牙發(fā)育依賴于來自外胚層的牙上皮和神經(jīng)嵴來源的牙間充質(zhì)之間的相互誘導(dǎo)和作用,這種作用是通過兩者之間一系列交互而有序的旁分泌生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的。這些信號(hào)分子能調(diào)控牙胚中基因的表達(dá)以及組織細(xì)胞的功能,決定牙間充質(zhì)與牙上皮的牙向分化命運(yùn)。牙器官的發(fā)育過程中,不同時(shí)期的牙胚組織還具備誘導(dǎo)牙齒發(fā)育潛能,通過特定的分泌型信號(hào)分子,可誘導(dǎo)非牙組織牙向分化。深入分析誘導(dǎo)牙齒發(fā)育潛能的關(guān)鍵分子組成,對(duì)利用干細(xì)胞及牙器官的發(fā)育原理進(jìn)行牙齒再生的研究將具有重要的提示,可為干細(xì)胞牙向的定向分化提供理論基礎(chǔ)。經(jīng)典重組實(shí)驗(yàn)證明,在E9.5天,誘導(dǎo)成牙潛能存在于牙上皮之中,E12.5天之后誘導(dǎo)成牙潛能轉(zhuǎn)移至牙間充質(zhì)中。E13.5天的牙間充質(zhì)能誘導(dǎo)E10.5天第二腮弓上皮(非牙源性上皮)發(fā)育成為牙齒。但利用這樣的重組體系進(jìn)行牙間充質(zhì)的誘導(dǎo)成牙潛能的研究效率低下,需要同時(shí)收獲兩個(gè)不同時(shí)期的胚胎進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn),而且E10.5天第二腮弓上皮較難分離。為了高效地開展牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能的研究,本研究將探究在小鼠同期胚胎中是否存在其他的能被牙間充質(zhì)誘導(dǎo)的非牙源性上皮組織,為牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能的研究提供充足而方便制備的非牙源性上皮來源。以小鼠相同胚胎時(shí)期的頭上皮組織、下頜上皮組織、肢芽上皮組織和背部上皮組織為非牙源性上皮來源,通過大量的重組實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)E14.5磨牙間充質(zhì)組織與E14.5下頜上皮組織的重組組合成牙效率最高(61.9%)。進(jìn)一步探究E14.5天下頜表皮組織與磨牙間充質(zhì)組織重組體的發(fā)育模式,發(fā)現(xiàn)能完全模擬小鼠磨牙的發(fā)育模式,E14.5天下頜表皮組織能正常分化成為成釉組織,并分泌釉質(zhì)。說明E14.5天下頜表皮組織完全可以替代E10.5天的第二腮弓上皮組織用于牙間充質(zhì)的誘導(dǎo)成牙潛能研究,并具快捷方便性。近年來,干細(xì)胞在牙再生研究中的應(yīng)用越來越廣泛。已有研究報(bào)道誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,表皮干細(xì)胞以及牙齦上皮干細(xì)胞都能夠被間充質(zhì)誘導(dǎo)牙向分化。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)人的表皮干細(xì)胞也是可以作為一種非牙源性上皮的來源進(jìn)行小鼠牙間充質(zhì)的誘導(dǎo)成牙潛能研究,但是也存在成牙效率低下的不足。本研究將在此基礎(chǔ)上,將不同比例的表皮干細(xì)胞與E13.5天小鼠牙間充質(zhì)進(jìn)行重組,探究成牙率最高的細(xì)胞比率。通過不同細(xì)胞比例的實(shí)驗(yàn),本研究發(fā)現(xiàn)人表皮干細(xì)胞與E13.5天小鼠牙間充質(zhì)細(xì)胞的比例為1：9時(shí),重組體具有最高的成牙率,達(dá)到92.6%,同時(shí)也能完全模擬牙齒的發(fā)育模式,人表皮干細(xì)胞也能分化成為成釉細(xì)胞,分泌釉質(zhì)。本研究建立了一套高效的牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能的體系,為后續(xù)的誘導(dǎo)成牙潛能的功能研究奠定了基礎(chǔ)。許多生長(zhǎng)因子在小鼠牙發(fā)育過程中各個(gè)階段的表達(dá)模式已經(jīng)得到了充分的研究。生長(zhǎng)因子在不同組織的不同發(fā)育階段的誘導(dǎo)成牙潛能中承擔(dān)非常重要的作用。尋找成牙潛能的分子構(gòu)成,是揭示成牙潛能的關(guān)鍵所在。本研究為了探究小鼠磨牙誘導(dǎo)成牙潛能的分子構(gòu)成,首先通過體外器官培養(yǎng)體系,建立了小鼠磨牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能的丟失模型。將E14.5天的小鼠磨牙間充質(zhì)體外分別培養(yǎng)24h,48h小時(shí)后,分別與非牙源性表皮重組,發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)24小時(shí)后,小鼠磨牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙能力大幅下降,成牙率僅為19.2%。而在培養(yǎng)48小時(shí)后,誘導(dǎo)成牙潛能完全則完全喪失。通過細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后的牙間充質(zhì)組織未發(fā)生壞死和凋亡,因此我們推測(cè)在牙間充質(zhì)體外器官培養(yǎng)過程中,是由于某些基因的表達(dá)變化導(dǎo)致了誘導(dǎo)成牙潛能的丟失。本研究進(jìn)一步利用RNA-Seq分析的方法,將體外培養(yǎng)Oh,24h,48h三個(gè)時(shí)間的E14.5小鼠磨牙間充質(zhì)提取總RNA,進(jìn)行RNA測(cè)序,通過系統(tǒng)生物信息學(xué)分析,篩選出基因表達(dá)量顯著下調(diào)的基因有99個(gè),同時(shí)基因表達(dá)量上調(diào)的基因有409個(gè)。通過GO功能富集分析,最顯著富集的GO功能類別為oxygen binding、oxygen transport、oxygen transporter activity、organ development、 binding、cytosolic part、Multicellular organismal development。共富集包含39個(gè)基因,其中可能與誘導(dǎo)成牙潛能丟失相關(guān)的基因?yàn)镕gf3和Sfrp4。因此篩選得到Fgf3、Sfrp4作為誘導(dǎo)成牙潛能相關(guān)的候選關(guān)鍵分子。其中,Fgf3的表達(dá)水平隨間充質(zhì)組織在體外培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而顯著下調(diào),Sfrp4在間充質(zhì)組織在體外培養(yǎng)過程中顯著上調(diào)。本研究利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因功能缺失技術(shù)和瓊脂糖微球外源蛋白吸附手段,進(jìn)一步探究Fgf3和Sfrp4是否是調(diào)控小鼠牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能的關(guān)鍵信號(hào)分子。本研究首先選取了與牙齒發(fā)育相關(guān)的Msxl和Pax9作為陽性對(duì)照,篩選了組脫靶率低,敲除效果好的sgRNA。在細(xì)胞水平上建立了一套快速篩選sgRNA的方法,并在牙胚重組體系中建立了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的慢病毒干擾表達(dá)體系。在E13.5天小鼠磨牙間充質(zhì)細(xì)胞中沉默Msxl和Pax9的表達(dá),不能誘導(dǎo)非牙源性的上皮細(xì)胞牙向分化,證明我們建立的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因功能沉默體系有效可行。在E13.5天小鼠磨牙間充質(zhì)細(xì)胞中沉默F(xiàn)g/3的表達(dá),與非牙源性的上皮細(xì)胞重組,探究Fgf3的功能缺失是否導(dǎo)致誘導(dǎo)成牙潛能的喪失,通過慢病毒感染小鼠牙間充質(zhì)組織,并與非牙源性上皮組織重組。研究表明牙間充質(zhì)細(xì)胞中Fgf3的表達(dá)缺失并不會(huì)明顯下調(diào)誘導(dǎo)成牙潛能。在14.5磨牙間充質(zhì)中敲除sFrp4后體外培養(yǎng)48h,與非牙源性上皮重組,未能挽救誘導(dǎo)成牙潛能。然而,本研究通過瓊脂糖微球外源蛋白吸附手段,在E14.5天牙間充質(zhì)組織中添加外源蛋白FGF3后,與非牙源性上皮組織重組,結(jié)果表明外源添加FGF3生長(zhǎng)因子能顯著挽救牙間充質(zhì)丟失的誘導(dǎo)成牙潛能,成牙率達(dá)到43.8%。綜上所述,本研究通過將小鼠磨牙間充質(zhì)與同時(shí)期的不同非牙源性組織重組,以及不同比例人表皮干細(xì)胞與小鼠牙間充質(zhì)細(xì)胞的重組,建立了簡(jiǎn)便研究牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能的重組體發(fā)育模型。其中E14.5磨牙間充質(zhì)與E14.5下頜上皮組織的重組成牙率達(dá)到61.9%,E13.5磨牙間充質(zhì)細(xì)胞與人表皮干細(xì)胞的重組成牙率達(dá)到92.6%。利用小鼠牙間充質(zhì)體外器官培養(yǎng)體系,建立了牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能的丟失模型,發(fā)現(xiàn)小鼠E14.5磨牙間充質(zhì)在體外培養(yǎng)24h誘導(dǎo)成牙潛能顯著下降,48h后則完全喪失誘導(dǎo)成牙潛能。通過對(duì)誘導(dǎo)成牙潛能存在顯著差異的間充質(zhì)組織進(jìn)行RNA-Seq分析,篩選出了牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能的關(guān)鍵分子Fgf3和Sfrp4。最后通過基因的功能缺失和瓊脂糖外源蛋白吸附手段,探究篩選得到的關(guān)鍵分子在小鼠磨牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能中的作用。成功建立由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的慢病毒沉默體系,在磨牙間充質(zhì)細(xì)胞中對(duì)Fgf3和Sfrp4分別進(jìn)行功能沉默,對(duì)成牙潛能并無明顯影響。而在已丟失誘導(dǎo)成牙潛能的間充質(zhì)中添加外源蛋白FGF3,能夠明顯挽救誘導(dǎo)成牙潛能,證明Fgf3是小鼠磨牙間充質(zhì)誘導(dǎo)成牙潛能的關(guān)鍵分子。
【關(guān)鍵詞】：誘導(dǎo)潛能 RNA測(cè)序 CRISP/Cas9 Fgf3
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q344
【目錄】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-9
• 中文文摘9-15
• 緒論15-29
• 第一章 小鼠磨牙間充質(zhì)誘導(dǎo)非牙源性上皮牙向分化29-65
• 1.1 引言29-30
• 1.2 材料與方法30-48
• 1.3 結(jié)果48-62
• 1.4 討論62-65
• 第二章 小鼠磨牙間充質(zhì)成牙潛能關(guān)鍵分子的篩選65-85
• 2.1 引言65-66
• 2.2 材料與方法66-70
• 2.3 結(jié)果70-83
• 2.4 討論83-85
• 第三章 誘導(dǎo)成牙潛能候選關(guān)鍵分子的功能驗(yàn)證85-109
• 3.1 引言85-86
• 3.2 材料與方法86-90
• 3.3 結(jié)果90-105
• 3.4 討論105-109
• 附錄1109-113
• 附錄2113-115
• 參考文獻(xiàn)115-125
• 攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果125-127
• 致謝127-129
• 索引129-131
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷131-135

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 董蕊,金巖,劉源,趙宇,王容;表皮干細(xì)胞在成人及胎兒不同部位皮膚中的比較研究[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年18期

2 ;De novo transcriptome assembly of RNA-Seq reads with different strategies[J];Science China(Life Sciences);2011年12期

  本文關(guān)鍵詞：小鼠磨牙間充質(zhì)成牙潛能的關(guān)鍵分子，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：378991