發(fā)布時間：2017-05-19 10:14

  本文關(guān)鍵詞：基于多組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的小鼠lincRNA的鑒定和功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：哺乳動物基因組是普遍轉(zhuǎn)錄的,但蛋白編碼基因只占這些轉(zhuǎn)錄本的一小部分,絕大部分是非編碼RNA。非編碼RNA在調(diào)控基因表達方面有重要的功能。lincRNA作為一類重要的非編碼RNA,可以在染色質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等多個層次以誘餌RNA、增強子RNA、核支架、snoRNA的宿主基因、microRNA的前體和競爭內(nèi)源性RNA等形式來調(diào)控基因表達。lincRNA參與了多個生物過程,比如基因印跡、X染色體失活、細胞周期、配子形成、多能細胞的分化發(fā)育等。近幾年來,lincRNA被發(fā)現(xiàn)參與了心臟病、地中海貧血、阿爾茨海默病等多種疾病過程,尤其是與肺癌、胃癌、乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程關(guān)系密切。因此,鑒定lincRNA,構(gòu)建全面完整的lincRNA數(shù)據(jù)集,可以為lincRNA的功能和進化研究奠定基礎(chǔ),對癌癥的診斷和治療有重要的意義。本研究分別針對小鼠的SOLiD數(shù)據(jù)和Solexa數(shù)據(jù)開發(fā)了鑒定lincRNA的流程,并對這些lincRNA的轉(zhuǎn)錄活性特征、表達譜和功能等進行了深入研究。采用去核糖體的方法在SOLiD平臺上對小鼠的大腦、睪丸和胚胎干細胞進行測序。這些樣品的SOLiD數(shù)據(jù)分別有245,032,381、280,932,595和88,306,412條序列比對到基因組上。根據(jù)序列比對結(jié)果,按照我們鑒定外顯子的流程分別鑒定出395,546、465,149和194,996個外顯子。利用refGene來評估這些外顯子的準確性,結(jié)果顯示,有94.12%的refGene外顯子被鑒定出來,并且匹配長度達到88.71%。去除在已知數(shù)據(jù)庫中注釋的外顯子后獲得新外顯子,結(jié)合RNAPII和H3K36me3數(shù)據(jù),在大腦、睪丸和胚胎干細胞中分別鑒定出17,931、18,512和6,966個轉(zhuǎn)錄本。利用Fantom3中注釋的RNA來評估轉(zhuǎn)錄本的準確性,結(jié)果表明,一對一匹配率為95.62%,匹配長度為70.99%。對這些轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄活性特征進行分析發(fā)現(xiàn),CAGE、 RNAPⅡ、H3K4me3在轉(zhuǎn)錄本上游明顯富集,H3K36me3在轉(zhuǎn)錄本的body區(qū)富集,以上結(jié)果說明這些新轉(zhuǎn)錄本有一定的轉(zhuǎn)錄活性,是獨立的轉(zhuǎn)錄單元。通過利用PhyloCSF預(yù)測這些新轉(zhuǎn)錄本的編碼可能性,然后去除小非編碼RNA,最終在大腦、睪丸和胚胎干細胞中分別鑒定出3,329、5,371和1,960個lincRNA。利用我們開發(fā)的鑒定lincRNA的流程,從15個小鼠鏈特異的Solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定出11,022個lincRNA(8182個lincRNA基因)。對這些lincRNA進行基因組特征分析發(fā)現(xiàn),與蛋白編碼基因相比,lincRNA基因長度短,外顯子個數(shù)少,外顯子長度短；但是在外顯子個數(shù)相同的情況下,lincRNA基因的基因和內(nèi)含子長度都比蛋白編碼基因長。進一步分析發(fā)現(xiàn),造成lincRNA基因內(nèi)含子長的原因主要在于lincRNA內(nèi)含子區(qū)含有大量repeat,特別是LTR和LINE比例很高,導(dǎo)致在外顯子個數(shù)相同的情況下lincRNA基因比蛋白編碼基因長。對lincRNA所進行的轉(zhuǎn)錄活性分析(包括CAGE、RNAPⅡ、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3等)結(jié)果與SOLiD數(shù)據(jù)鑒定的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄活性結(jié)果一致。從表達水平來看,lincRNA基因表達量低,組織特異性強。利用GSEA預(yù)測lincRNA的功能,結(jié)果表明lincRNA與很多有明確功能分類的蛋白編碼基因相關(guān),如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、減數(shù)分裂、能量代謝和凝血反應(yīng)等。每個組織的lincRNA大多與各自的生理功能相關(guān)。例如,睪丸中的lincRNA主要與生殖發(fā)育相關(guān),包括減數(shù)分裂、主要性別特征發(fā)育、有性生殖和配子形成等；在大腦中,lincRNA與大腦發(fā)育、突觸發(fā)生、軸突形成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)。為了驗證鑒定的lincRNA的真實性,隨機選擇16個組成型表達的lincRNA和42個組織特異性lincRNA進行RT-PCR實驗,大部分lincRNA可以檢測到陽性表達。本論文的工作為鑒定和描述lincRNA提供了方法,更重要的是擴展了小鼠的lincRNA數(shù)據(jù)集,為今后lincRNA的功能研究奠定了基礎(chǔ),為相關(guān)的功能實驗提供了豐富的候選資源。
【關(guān)鍵詞】：新一代測序技術(shù) 轉(zhuǎn)錄組 非編碼RNA lincRNA 小鼠
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 專業(yè)詞匯中英文對照表10-15
• 1 引言15-41
• 1.1 lincRNA概述15-18
• 1.1.1 RNA研究歷史15-16
• 1.1.2 lincRNA早期發(fā)現(xiàn)16-17
• 1.1.3 lincRNA大規(guī)模鑒定17
• 1.1.4 lincRNA功能研究17-18
• 1.2 lincRNA研究方法18-27
• 1.2.1 lincRNA研究方法概述18-19
• 1.2.2 新一代測序技術(shù)19-27
• 1.2.2.1 Roche/454測序平臺20-21
• 1.2.2.2 Illumina/Solexa測序平臺21-24
• 1.2.2.3 ABI/SOLiD測序平臺24-27
• 1.3 非編碼RNA數(shù)據(jù)庫27-28
• 1.4 lincRNA的功能28-34
• 1.4.1 表觀調(diào)控29-31
• 1.4.2 轉(zhuǎn)錄水平31-32
• 1.4.3 轉(zhuǎn)錄后水平32-33
• 1.4.4 其它功能33-34
• 1.5 lincRNA與癌癥34-37
• 1.6 lincRNA的研究現(xiàn)狀及趨勢37-41
• 2 材料與方法41-59
• 2.1 SOLiD實驗材料及試劑41-42
• 2.1.1 SOLiD實驗材料41
• 2.1.2 SOLiD實驗試劑41
• 2.1.3 試劑盒41-42
• 2.2 SOLiD轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建42-43
• 2.2.1 總RNA提取42
• 2.2.2 rRNA去除42
• 2.2.3 文庫構(gòu)建42-43
• 2.3 ChIP-seq實驗方法43-44
• 2.4 公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集44
• 2.5 SOLiD數(shù)據(jù)分析方法44-47
• 2.5.1 rmRNA-seq數(shù)據(jù)飽和度評估44
• 2.5.2 基于rmRNA-seq數(shù)據(jù)鑒定外顯子和構(gòu)建基因間區(qū)轉(zhuǎn)錄本44-45
• 2.5.3 利用ChIP-seq數(shù)據(jù)鑒定甲基化修飾區(qū)間45
• 2.5.4 轉(zhuǎn)錄本的外顯子和啟動子保守性分析45-46
• 2.5.5 鑒定lincRNA46
• 2.5.6 Sense和antisense基因表達相關(guān)性分析46-47
• 2.6 Solexa實驗材料及試劑47-48
• 2.6.1 實驗材料47
• 2.6.2 實驗試劑47-48
• 2.6.3 試劑盒48
• 2.7 實驗方法48-55
• 2.7.1 大腦總RNA提取48
• 2.7.2 rRNA去除48
• 2.7.3 Solexa strand-specific RNA-Seq文庫構(gòu)建48-53
• 2.7.3.1 DNasel消化及片段化處理48-49
• 2.7.3.2 添加接頭49-51
• 2.7.3.3 反轉(zhuǎn)錄51
• 2.7.3.4 切膠回收51-52
• 2.7.3.5 PCR擴增52
• 2.7.3.6 用AMPure Beads純化文庫52-53
• 2.7.3.7 上機測序53
• 2.7.4 RT-PCR53-55
• 2.8 下載公共數(shù)據(jù)庫中小鼠RNA-Seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)集55
• 2.9 Solexa數(shù)據(jù)分析方法55-59
• 2.9.1 序列比對和轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建55
• 2.9.2 lincRNA鑒定流程55-56
• 2.9.3 lincRNA基因和蛋白編碼基因內(nèi)含子區(qū)repeat分析56
• 2.9.4 lincRNA的轉(zhuǎn)錄活性和保守性分析56-57
• 2.9.5 lincRNA鄰近蛋白編碼基因功能研究57
• 2.9.6 lincRNA的表達譜分析57
• 2.9.7 lincRNA功能預(yù)測57-58
• 2.9.8 1incRNA的直系同源序列及共線性直系同源轉(zhuǎn)錄本查找58-59
• 3 結(jié)果與討論59-95
• 3.1 SOLiD數(shù)據(jù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本59-65
• 3.1.1 鑒定外顯子59-62
• 3.1.2 注釋新的外顯子62-63
• 3.1.3 構(gòu)建基因間區(qū)的新轉(zhuǎn)錄本63-65
• 3.2 基因間區(qū)新轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄活性特征65
• 3.3 新轉(zhuǎn)錄本的分類和功能分析65-73
• 3.3.1 新的蛋白編碼基因65-69
• 3.3.2 新的ncRNA69-71
• 3.3.3 內(nèi)含子區(qū)的新轉(zhuǎn)錄本71-73
• 3.4 SOLiD結(jié)果討論73
• 3.5 Solexa數(shù)據(jù)鑒定lincRNA的流程73-74
• 3.6 lincRNA的基因組特征74-75
• 3.7 lincRNA基因的轉(zhuǎn)錄活性和保守性75-81
• 3.7.1 lincRNA轉(zhuǎn)錄起始位點特征80
• 3.7.2 lincRNA的甲基化修飾80
• 3.7.3 lincRNA的保守性80-81
• 3.8 lincRNA的表達譜81-82
• 3.9 lincRNA的功能82-87
• 3.10 實驗驗證87-89
• 3.11 Solexa結(jié)果討論89-95
• 4 總結(jié)與展望95-97
• 參考文獻97-111
• 附錄111-117
• 作者簡介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果117

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