線性泛素鏈是真核細胞內一種特殊多聚泛素鏈,由LUBAC復合物發(fā)揮泛素連接酶活性,催化泛素蛋白通過肽鍵首尾連接而成。線性泛素鏈參與調節(jié)多個細胞生理過程,包括NF-κB信號通路、細胞自噬等。病原菌在長期與宿主斗爭中,進化出多種逃逸宿主免疫系統(tǒng)的機制。先前已有研究報道,多種病原菌能夠分泌具有去泛素化酶活性的效應蛋白,但這些效應蛋白都只能水解以異肽鍵連接的泛素鏈,因此,病原菌中是否存在具有特異性水解線性泛素鏈活性的效應蛋白,成為了 一個長期存在的科學疑問。為了解決這個問題,我們針對病原菌效應蛋白建立了去泛素化酶的篩選體系。通過篩選我們發(fā)現(xiàn),嗜肺軍團菌中的效應蛋白RavD,能夠特異性水解線性泛素鏈。為了揭示RavD的酶活機制,我們通過結構生物學研究,解析了 RavD同源蛋白RavD1c與線性連接的diUb復合物的晶體結構。從結構中我們發(fā)現(xiàn),RavD是一個木瓜蛋白酶樣的去泛素化酶,具有Cys-His-Ser催化三聯(lián)體基序,其三維結構不同于其他去泛素化酶,是一個擁有全新結構的去泛素化酶。RavD結合diUb的兩個結合面以及介導和diUb之間相互作用的關鍵性氨基酸殘基決定了 RavD去泛素化酶活性的特... 

【文章頁數(shù)】：131 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 真核細胞泛素化修飾
        1.1.1 泛素化修飾概述
        1.1.2 泛素化修飾過程
        1.1.3 多聚泛素鏈的功能
        1.1.4 去泛素化酶
        1.1.5 線性泛素鏈的研究現(xiàn)狀
    1.2 嗜肺軍團菌
        1.2.1 嗜肺軍團菌概況
        1.2.2 嗜肺軍團菌的感染過程
        1.2.3 嗜肺軍團菌表面毒力因子
        1.2.4 嗜肺軍團菌的分泌系統(tǒng)
    1.3 病原菌干擾宿主泛素化修飾
        1.3.1 干擾細胞泛素系統(tǒng)組分
        1.3.2 分泌具有E3連接酶活性的效應蛋白
            1.3.2.1 介導經(jīng)典泛素化修飾
            1.3.2.2 介導非經(jīng)典泛素化修飾
        1.3.3 分泌具有DUB活性的效應蛋白
        1.3.4 其他影響
            1.3.4.1 利用泛素系統(tǒng)調控效應蛋白活性
            1.3.4.2 利用泛素化修飾降解其他效應蛋白
    1.4 本研究的研究意義
2 材料與方法
    2.1 材料
    2.2 實驗方法
        2.2.1 分子克隆
            2.2.1.1 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的基因
            2.2.1.2 PCR產(chǎn)物回收
            2.2.1.3 目的基因定點突變
            2.2.1.4 酶切
            2.2.1.5 連接或重組
            2.2.1.6 轉化
            2.2.1.7 目的基因陽性單克隆鑒定
            2.2.1.8 質粒抽提
        2.2.2 蛋白表達與純化
            2.2.2.1 大腸桿菌表達蛋白
            2.2.2.2 親和層析純化標簽蛋白
            2.2.2.3 純化無標簽蛋白
            2.2.2.4 離子交換柱純化
            2.2.2.5 分子篩純化
        2.2.3 免疫印跡
        2.2.4 細胞轉染
        2.2.5 真核細胞蛋白表達檢測
        2.2.6 免疫熒光實驗
        2.2.7 培養(yǎng)嗜肺軍團菌
        2.2.8 構建基因敲除和基因回補的嗜肺軍團菌菌株
        2.2.9 制備與轉化嗜肺軍團菌電轉感受態(tài)
        2.2.10 合成泛素鏈
        2.2.11 病原菌篩選實驗
        2.2.12 篩選嗜肺軍團菌的效應蛋白
        2.2.13 RavD重組蛋白去泛素化酶活性驗證
        2.2.14 酶解反應后產(chǎn)生的單泛素蛋白再合鏈實驗
        2.2.15 RavD重組蛋白水解M1-diUb實驗
        2.2.16 RavD與GST-Ub,Flag-Ub和Ub-Flag的酶切實驗
        2.2.17 GST-diUb pull-down實驗
        2.2.18 GST-NEMO UBAN pull-down實驗
        2.2.19 RavD抑制細胞內IκBα降解實驗
        2.2.20 核內p65轉運實驗
        2.2.21 磷脂結合實驗
        2.2.22 構建OTULIN敲除的U937細胞系
        2.2.23 檢測LCV周圍的線性鏈
        2.2.24 檢測感染過程中RavD對NF-κB信號通路的影響
        2.2.25 檢測RavD對細胞內嗜肺軍團菌增殖的影響
        2.2.26 RavD定位實驗
        2.2.27 蛋白結晶和結構分析
3 結果與分析
    3.1 嗜肺軍團菌具有水解線性泛素鏈活性
    3.2 嗜肺軍團菌效應蛋白RavD發(fā)揮水解線性泛素鏈的活性
    3.3 RavD是一個特異性水解線性泛素鏈的DUB
        3.3.1 RavD對底物具有特異性
        3.3.2 RavD是一個去泛素化酶
    3.4 RavD和M1-diUb直接相互作用
    3.5 RavD與M1-diUb復合物的三維結構
        3.5.1 RavD的三維結構
        3.5.2 RavD具有Cys-His-Ser催化三聯(lián)體基序
        3.5.3 RavD特異性的決定因素
    3.6 RavD抑制細胞內NF-κB信號通路
    3.7 RavD在嗜肺軍團菌感染過程中的影響
        3.7.1 RavD分泌后定位在LCV膜上
        3.7.2 RavD抑制線性泛素鏈在LCV上積累
        3.7.3 RavD抑制感染過程中NF-κB信號通路激活
        3.7.4 RavD對嗜肺軍團菌在細胞內增殖幾乎沒有影響
    3.8 RavD廣泛存在于軍團菌不同菌種中
4 討論
    4.1 結論
    4.2 討論與展望
參考文獻
作者簡歷



本文編號：3666639