本文關鍵詞：應用膜片鉗電生理技術研究多肽毒素對鉀離子通道的作用機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：離子通道是膜蛋白的一種,它在生命活動中起著非常重要的作用。由于離子通道的一些突變會導致人類疾病,因此相關藥理學方面的研究也非常重要。目前對離子通道的研究主要有利用X射線晶體衍射或者液體核磁共振技術解析它們的結構,利用膜片鉗電生理技術研究它們的功能等等。動物多肽毒素通常能夠作用于離子通道,調節(jié)它們的開放和關閉。它們是研究離子通道結構與功能的工具,同時也能被改造或修飾,用于疾病的治療。本文中我們主要用蛋白異源表達純化的方法獲得多肽毒素,用液體核磁共振技術以及膜片鉗電生理技術研究動物多肽毒素和鉀離子通道的相互作用。論文共分為四個章節(jié)。第一章介紹了鉀離子通道和相關動物多肽毒素的基本知識。包括鉀離子通道的類型,鉀離子通道相關疾病以及多肽毒素的種類、結構,與鉀離子通道相互作用模式等。第二章對膜片鉗電生理技術作了簡單的介紹,包括膜片鉗的幾種基本模式以及衍生技術,主要的相關設備等。第三章是蜈蚣多肽毒素SSD609對KCNQ1/KCNE1鉀離子通道作用機制的研究。作用于KCNQ1/KCNE1鉀離子通道的多肽毒素很少,目前只有兩篇文章報道過相關內容,蜈蚣毒腺中提取的SSD609就是其中的一種。而KCNQ1/KCNE1鉀離子通道與人類心臟疾病密切相關,作用于它的毒素有潛在的作為藥物的可能。本章我們通過大腸桿菌異源表達純化的方法獲得較為大量的SSD609多肽毒素,通過膜片鉗電生理技術驗證其抑制Iks電流的功能,證明其與天然狀態(tài)的毒素擁有類似的生理功能。之后利用液體核磁共振技術解析了它的結構,由三段α螺旋構成,此結構在動物多肽毒素中非常少見。根據結構和功能提供的信息,猜測其作用于KCNE1輔助亞基,因此設計了KCNE1上相關位點的突變,結合電生理實驗推斷出SSD609與KCNQ1/KCNE1可能的相互作用方式,首次提出多肽毒素作用于輔助亞基,這為以后進一步的研究打下基礎。第四章主要介紹了蝎毒素IbTX的表達純化以及它對BK鉀離子通道的抑制作用。異源表達多肽毒素為一種獲取毒素的常用方法,相對來說這種方法時間短、花費少,而且可以對毒素做些簡單的改造。融合標簽能夠幫助多肽毒素表達,但用酶切的方法除去標簽時容易引入多余氨基酸殘基。本章我們使用兩種不同的酶來切除IbTX的融合標簽,使用膜片鉗電生理技術研究它們對BK鉀離子通道的作用,證明有時候多余一個氨基酸會對多肽毒素的功能產生較大的改變。
【關鍵詞】：鉀離子通道 多肽毒素 膜片鉗 電生理
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q25
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 鉀離子通道及離子通道毒素簡介11-35
• 1.1 鉀離子通道背景介紹11-16
• 1.1.1 鉀離子通道簡介11-12
• 1.1.2 鉀離子通道類型12-14
• 1.1.3 鉀離子通道研究現狀14-16
• 1.2 鉀離子通道毒素16-23
• 1.2.1 多肽毒素簡介16-17
• 1.2.2 不同動物來源的鉀離子通道毒素17-19
• 1.2.3 鉀離子通道毒素與相關疾病的研究現狀19-20
• 1.2.4 鉀離子通道毒素的結構研究20-23
• 1.3 多肽毒素和鉀離子通道的相互作用模式23
• 1.4 本文主要研究內容23-25
• 參考文獻25-35
• 第二章 膜片鉗電生理技術35-47
• 2.1 膜片鉗技術簡介35-39
• 2.1.1 膜片鉗技術的基本模式35-37
• 2.1.2 膜片鉗的其他衍生技術37-39
• 2.2 膜片鉗實驗相關的設備39-42
• 2.3 膜片鉗電生理實驗的灌流與給藥42-43
• 2.4 膜片鉗技術中基本概念簡介43-45
• 2.4.1 電流、電壓和電阻43-44
• 2.4.2 電導44-45
• 2.4.3 電容45
• 2.5 本章小結45-46
• 參考文獻46-47
• 第三章 SSD609對KCNQ1/KCNE1通道的作用機制研究47-93
• 3.1 引言47
• 3.2 背景介紹47-55
• 3.2.1 KCNQ1離子通道簡介47-49
• 3.2.2 KCNQ1離子通道的電生理性質49-50
• 3.2.3 KCNQ1/KCNE1通道與相關疾病50-52
• 3.2.4 KCNQ1/KCNE1通道相關多肽毒素研究現狀52-53
• 3.2.5 蜈蚣毒素SSD609簡介53-55
• 3.3 實驗材料和方法55-69
• 3.3.1 實驗材料和相關儀器55-56
• 3.3.2 蜈蚣毒素SSD609的表達純化56-57
• 3.3.3 SSD609蛋白重折疊57
• 3.3.4 質粒構建57-58
• 3.3.5 分子克隆與位點特異性突變58-62
• 3.3.6 細胞培養(yǎng)和質粒轉染62-64
• 3.3.7 豚鼠和大鼠心肌細胞的急性分離64-66
• 3.3.8 膜片鉗電生理實驗66-68
• 3.3.9 膜片鉗電生理數據分析68
• 3.3.10 液體核磁共振解析SSD609結構68-69
• 3.4 實驗結果和討論69-82
• 3.4.1 SSD609的表達純化及二硫鍵重建69-71
• 3.4.2 SSD609的功能驗證71-76
• 3.4.3 SSD609對其他鉀離子通道的選擇性76-78
• 3.4.4 SSD609的液體核磁共振結構解析78-80
• 3.4.5 SSD609與KCNQ1/KCNE1的相互作用位點研究80-82
• 3.5 本章總結82-86
• 參考文獻86-93
• 第四章 IbTX的表達純化及其對BK通道的抑制作用初探93-113
• 4.1 引言93-94
• 4.2 背景介紹94-98
• 4.2.1 BK鉀離子通道簡介94-97
• 4.2.2 IbTX多肽毒素簡介97-98
• 4.3 實驗材料與方法98-101
• 4.3.1 質粒構建98-99
• 4.3.2 IbTX的表達純化99-100
• 4.3.3 SUMO酶的表達純化100-101
• 4.3.4 IbTX的環(huán)化101
• 4.3.5 細胞培養(yǎng)和質粒轉染101
• 4.3.6 膜片鉗電生理實驗和數據處理101
• 4.4 實驗結果與討論101-108
• 4.4.1 SIbTX的表達純化以及質譜驗證102-104
• 4.4.2 cIbTX的表達純化以及質譜驗證104-107
• 4.4.3 SIbTX和cIbTX對BK鉀離子通道的作用107-108
• 4.5 本章總結108-109
• 參考文獻109-113
• 致謝113-115
• 在讀期間發(fā)表的學術論文與取得的研究成果115

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