本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)HOXA10基因小鼠和豬的制備及基因功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：繁殖性狀是影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一,其中產(chǎn)仔數(shù)是衡量母豬繁殖性狀的一個(gè)重要指標(biāo)。提高產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵在于降低豬胚胎/胎兒死亡率,提高胎兒存活率。而胚胎死亡絕大多數(shù)發(fā)生在胚胎附植前或附植期間,因此胚胎附植是影響母豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵時(shí)期。有研究表明轉(zhuǎn)錄因子HOXA10基因(同源異形框A10基因)受雌激素、孕激素調(diào)控,高表達(dá)于著床窗口期,對(duì)胚胎附植的建立、妊娠的維持等具有重要作用。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備特定時(shí)期在特異組織中高表達(dá)HOXA10基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,降低胚胎死亡,提高產(chǎn)仔數(shù)是我們努力的目標(biāo)。本研究通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為制備高繁殖力轉(zhuǎn)基因豬奠定基礎(chǔ);通過轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù),以期獲得高繁殖潛力的轉(zhuǎn)基因克隆豬,獲取新的科研材料;深入了解HOXA10基因在胚胎發(fā)育和附植過程中的調(diào)控機(jī)理,對(duì)于提高母豬產(chǎn)仔數(shù)具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究主要研究結(jié)果如下:1.采用顯微注射法制備轉(zhuǎn)HOXA10基因小鼠,通過Southern及外源插入片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增對(duì)G0代陽性小鼠進(jìn)行鑒定。對(duì)G2代陽性小鼠的各組織中Hoxa10基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在腎臟、膀胱和子宮內(nèi)膜組織中有表達(dá),在心臟、脾臟和卵巢中有痕量表達(dá)。G2代母鼠腹腔注射雌激素、孕激素來誘導(dǎo)Hoxa10基因表達(dá),使用Q-PCR及Western blot檢測(cè)Hoxa10表達(dá)的差異,并用Q-PCR檢測(cè)受Hoxa10調(diào)控的下游基因:ETA(內(nèi)皮素受體A)和Phgdh(磷酸甘油酸脫氫酶),發(fā)現(xiàn)這些基因在轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)具有差異。統(tǒng)計(jì)分析經(jīng)產(chǎn)胎次的G2代小鼠產(chǎn)仔數(shù),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠比非轉(zhuǎn)基因小鼠提高產(chǎn)仔數(shù)約1只(P=0.08),可以認(rèn)為轉(zhuǎn)HOXA10基因小鼠的產(chǎn)仔數(shù)有增加的趨勢(shì)。2.對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的6頭G0代轉(zhuǎn)HOXA10基因克隆公豬進(jìn)行傳代,產(chǎn)生了56頭G1代小豬,經(jīng)檢測(cè)有25頭為陽性,其中11頭雌性。檢測(cè)G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬12個(gè)組織中HOXA10的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:HOXA10基因在腎臟、大腸和膀胱中的表達(dá)較高;肌肉和淋巴有微弱表達(dá);心臟、肝臟、脾臟、肺臟、脂肪、小腸和睪丸中未檢測(cè)到表達(dá)。3.對(duì)4頭G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬及部分G1代豬(陽性和陰性)進(jìn)行血液生理生化指標(biāo)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬及G1代公豬(陽性與陰性)血小板數(shù)目均低于非轉(zhuǎn)基因公豬和文獻(xiàn)報(bào)道的血小板數(shù)目。生化指標(biāo)中,G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬的睪酮含量低于非轉(zhuǎn)基因公豬,其它指標(biāo)沒有發(fā)現(xiàn)異常。4.通過對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pc3.1-PF3-HOXA10表達(dá)載體、G418篩選、單克隆挑選、PCR檢測(cè),建立了4株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HOXA10的陽性細(xì)胞系。5.利用胚胎移植技術(shù),核移植其中1株生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞,成功制備了3頭轉(zhuǎn)HOXA10基因克隆母豬。采用Q-PCR和染色體步移技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆母豬的外源基因拷貝數(shù)及整合位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)3頭豬的拷貝數(shù)分別為27.70、19.88、25.26,外源片段可能插入到4號(hào)、9號(hào)、13號(hào)、14號(hào)染色體上。6.采用Lnc RNA芯片,分析在Ishikawa細(xì)胞(子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株)中過表達(dá)HOXA10基因后,引起差異表達(dá)的m RNA和Lnc RNA。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOXA10基因后,有339個(gè)m RNA上調(diào)表達(dá),568個(gè)m RNA下調(diào)表達(dá)(Fold Change≥2,P0.05及Q0.05)。對(duì)過表達(dá)HOXA10基因后差異表達(dá)的m RNA進(jìn)行GO分析,發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的m RNA主要參與血管發(fā)育、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移等生物過程;下調(diào)表達(dá)的m RNA主要參與細(xì)胞周期、胞內(nèi)運(yùn)輸、蛋白核定位等生物過程。進(jìn)行KEGG通路分析時(shí),發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞周期等生物學(xué)通路。7.對(duì)Lnc RNA進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOXA10基因后,引起732個(gè)Lnc RNA上調(diào)表達(dá),294個(gè)Lnc RNA下調(diào)表達(dá)(Fold Change≥2,P0.05及Q0.05)。對(duì)全部Lnc RNA進(jìn)行亞組分析,共檢測(cè)到1,514條類似增強(qiáng)子的Lnc RNA,其中有43條上調(diào)表達(dá),16條下調(diào)表達(dá)。在9,987條基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA中,有274條上調(diào)表達(dá),98條下調(diào)表達(dá)。通過分析可能與胚胎附植相關(guān)的差異表達(dá)的m RNA相鄰的差異表達(dá)的Lnc RNA,來預(yù)測(cè)與胚胎附植相關(guān)的Lnc RNA。
【關(guān)鍵詞】：豬 HOXA10 轉(zhuǎn)基因 小鼠 Ishikawa細(xì)胞 LncRNA
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828;Q78
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 縮略詞表13-15
• 1 前言15-34
• 1.1 研究問題的由來15-16
• 1.2 胚胎附植16-17
• 1.2.1 豬胚胎/胎兒死亡的原因16-17
• 1.2.2 胚胎附植過程17
• 1.3 HOXA10 基因在胚胎附植過程中的作用17-23
• 1.3.1 HOXA10 基因概述17-18
• 1.3.2 HOXA10 基因與子宮內(nèi)膜容受性18-19
• 1.3.3 調(diào)節(jié)HOXA10 基因表達(dá)的因子19-20
• 1.3.4 HOXA10 調(diào)控的下游基因20-23
• 1.4 HOXA10 基因的其他功能研究23-24
• 1.5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究進(jìn)展24-29
• 1.5.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物24-25
• 1.5.2 轉(zhuǎn)基因豬的應(yīng)用前景及存在問題25-28
• 1.5.3 轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)在轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用28-29
• 1.6 LncRNA的研究進(jìn)展29-32
• 1.6.1 LncRNA概述29-31
• 1.6.2 LncRNA在家畜中的研究進(jìn)展31-32
• 1.6.3 LncRNA與胚胎附植32
• 1.7 研究目的與意義32-34
• 2 材料與方法34-62
• 2.1 材料34-41
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物34
• 2.1.2 細(xì)胞樣品34
• 2.1.3 載體及菌株34-36
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備36-37
• 2.1.5 主要試劑及試劑盒37-40
• 2.1.6 主要分子生物學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫40-41
• 2.2 研究方法41-62
• 2.2.1 本研究技術(shù)路線41-44
• 2.2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備與檢測(cè)44-53
• 2.2.3 轉(zhuǎn)基因克隆公豬的傳代與檢測(cè)53-54
• 2.2.4 轉(zhuǎn)基因克隆母豬的制備54-57
• 2.2.5 與HOXA10 表達(dá)相關(guān)的差異mRNA和LncRNA篩選57-62
• 3 結(jié)果62-94
• 3.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備與檢測(cè)62-70
• 3.1.1 制備轉(zhuǎn)基因小鼠外源片段的獲得62-63
• 3.1.2 G0 代轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測(cè)63-65
• 3.1.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代及產(chǎn)仔數(shù)的觀察65-67
• 3.1.4 G2 代轉(zhuǎn)基因小鼠Hoxa10 基因的表達(dá)檢測(cè)67-70
• 3.2 轉(zhuǎn)基因克隆公豬的傳代與檢測(cè)70-77
• 3.2.1 轉(zhuǎn)基因豬的擴(kuò)繁70
• 3.2.2 轉(zhuǎn)基因克隆公豬HOXA10 基因的組織表達(dá)檢測(cè)70-71
• 3.2.3 G0 代克隆公豬生理生化指標(biāo)測(cè)定71-73
• 3.2.4 轉(zhuǎn)基因G1 代豬生理生化指標(biāo)測(cè)定73-77
• 3.3 轉(zhuǎn)基因克隆母豬的制備與初步鑒定77-83
• 3.3.1 胎兒成纖維細(xì)胞的性別鑒定77
• 3.3.2 pc3.1-PF3-HOXA10 載體的線性化及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的構(gòu)建77-80
• 3.3.3 轉(zhuǎn)HOXA10 基因克隆母豬的初步鑒定80-83
• 3.4 與HOXA10 表達(dá)相關(guān)的差異mRNA和LncRNA功能預(yù)測(cè)83-94
• 3.4.1 pcDNA3.1(+)/HOXA10 載體構(gòu)建83
• 3.4.2 Ishikawa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及表達(dá)檢測(cè)83-84
• 3.4.3 用于LncRNA芯片雜交的RNA質(zhì)量檢測(cè)84-86
• 3.4.4 差異表達(dá)的mRNA和LncRNA的聚類分析86-90
• 3.4.5 差異表達(dá)mRNA的Gene Ontology與KEGG通路分析90-91
• 3.4.6 LncRNA的子類與亞組分析91-92
• 3.4.7 可能與胚胎附植相關(guān)的LncRNA92
• 3.4.8 差異表達(dá)mRNA和LncRNA的Q-PCR驗(yàn)證92-94
• 4 討論94-102
• 4.1 選擇豬HOXA10 基因作為目標(biāo)基因的理由94
• 4.2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備方法的評(píng)估94-96
• 4.2.1 顯微注射法與體細(xì)胞核移植法的比較94-95
• 4.2.2 供體細(xì)胞的選擇與陽性細(xì)胞系的建立95-96
• 4.2.3 胚胎移植96
• 4.3 關(guān)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)方法96-98
• 4.3.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定方法96
• 4.3.2 外源基因拷貝數(shù)及整合位點(diǎn)的檢測(cè)96-97
• 4.3.3 血液生理生化指標(biāo)的檢測(cè)97-98
• 4.4 關(guān)于本研究中轉(zhuǎn)基因小鼠部分的討論98-99
• 4.4.1 關(guān)于啟動(dòng)子的選擇98-99
• 4.4.2 誘導(dǎo)小鼠Hoxa10 基因表達(dá)及產(chǎn)仔數(shù)比較99
• 4.5 選擇LncRNA芯片進(jìn)行基因功能研究的討論99-102
• 4.5.1 LncRNA的研究方法99-100
• 4.5.2 LncRNA芯片結(jié)果的討論100-102
• 5 小結(jié)102-104
• 5.1 本研究的主要結(jié)論102-103
• 5.2 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)與特色103
• 5.3 本研究的不足與進(jìn)一步工作的設(shè)想103-104
• 參考文獻(xiàn)104-121
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文題錄121-122
• 致謝122-124

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：351643