本文關(guān)鍵詞：體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)克隆豬及轉(zhuǎn)基因豬程序的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：體細(xì)胞核移植技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,體細(xì)胞克隆包括許多環(huán)節(jié),影響克隆效率的包括很多重要因素,如受體卵母細(xì)胞的去核,以及重構(gòu)胚的表觀遺傳修飾,另外轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為供體細(xì)胞也受到很大的爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)嘗試從對(duì)化學(xué)輔助去核方法(Demecolcine處理)的深入探究,組蛋白去乙酰化抑制劑(CUDC-101)對(duì)表觀遺傳的修飾及轉(zhuǎn)基因(IFN-γ, scFv, IS)與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植生產(chǎn)克隆豬及轉(zhuǎn)基因豬三方面著手,進(jìn)一步對(duì)體細(xì)胞核移植生產(chǎn)克隆豬及轉(zhuǎn)基因豬的操作程序進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)一：Demecolcine (DEM)是一種微管破壞劑,在許多物種中已廣泛應(yīng)用于M Ⅱ卵母細(xì)胞的去核,然而,目前沒有報(bào)道探究這種方法對(duì)豬卵母細(xì)胞中細(xì)胞成熟促進(jìn)因子(MPF)分布的影響。(1)本實(shí)驗(yàn)探究了不同DEM處理時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟后MPF活性的影響。DEM處理豬卵母細(xì)胞0.5h、1h、2h、13h后MPF活性均高于對(duì)照組,在處理1h后MPF活性達(dá)到最高值,因此確定1h處理時(shí)間為DEME的最佳處理時(shí)間。(2)探究了DEM處理對(duì)豬卵母細(xì)胞去核后MPF及其亞基Cyclin B1的分布影響。我們分析了DEM處理后MPF水平和Cyclin B1在豬卵母細(xì)胞中的分布。我們證明了經(jīng)卵母細(xì)胞處理0.4 μg/ml DEM 1h影響了MPF的分布,使MPF的分布發(fā)生改變,集中于細(xì)胞質(zhì)中,從而提高去核后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)MPF濃度,極大限度的保留了MⅡ期卵母細(xì)胞MPF活性；免疫熒光染色觀察MPF的調(diào)解亞基Cyclin B1, DEM處理組中紡錘體微管被破壞并誘導(dǎo)染色質(zhì)凝集,Cyclin B1較為均勻的分布于整個(gè)卵母細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致MPF水平升高。(3)比較了化學(xué)輔助去核法和機(jī)械去核法去核效率及細(xì)胞質(zhì)中MPF含量的比較。分別采用化學(xué)輔助去核和機(jī)械去核法去除豬卵母細(xì)胞細(xì)胞核,對(duì)去核前后卵母細(xì)胞MPF水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)化學(xué)輔助去核法對(duì)卵母細(xì)胞MPF水平未有改變,而機(jī)械去核法使MPF水平降低。去核后注入五指山小型豬耳皮細(xì)胞,對(duì)重構(gòu)胚進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)化學(xué)輔助去核法的去核率及注核后細(xì)胞的發(fā)育,囊胚率均高于普通機(jī)械去核法,2.-4細(xì)胞發(fā)育率分別為80.6%、78.8%,囊胚率分別為16.3%、14.1%,差異并不顯著。體內(nèi)發(fā)育實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證化學(xué)輔助去核法優(yōu)于機(jī)械去核組。這為理解化學(xué)輔助去核方法提供理論根據(jù)。實(shí)驗(yàn)二：體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)的克隆動(dòng)物其成功率低,這與表觀遺傳異常有一定關(guān)聯(lián),這其中就包括組蛋白乙�；漠惓�。通過組蛋白去乙�；种苿�,可以改變表觀遺傳狀態(tài),從而進(jìn)一步提高體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育潛能。CUDC-101已經(jīng)有研究證明這種去乙�；种苿┛梢蕴岣呓M蛋白乙酰化水平,但是在體細(xì)胞克隆胚胎方面至今還未有人使用。本研究是使用CUDC-101探究其對(duì)豬體細(xì)胞核移植胚胎的影響。利用不同濃度的組蛋白去乙�；种苿〤UDC-101處理豬體細(xì)胞克隆胚胎24 h,尋找最適合濃度,隨后用最適濃度處理不同時(shí)間。確定好最佳時(shí)間和最佳濃度后,將胚胎通過胚胎移植移入代孕母豬體內(nèi),觀察其妊娠情況。結(jié)果：在體外發(fā)育的胚胎給予不同濃度的CUDC-101處理,觀察各濃度對(duì)于胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)1μM的CUDC-101處理24h的胚胎與對(duì)照組以及0.5,10μM處理組相比,其囊胚率明顯提高,分別為18.1%,9.9%,8.1%和0.0%(P0.05)。用1μM的CUDC-101處理重構(gòu)胚不同的時(shí)間,并在處理后激活胚胎。結(jié)果可知,經(jīng)24 h處理的胚胎,囊胚率高于其他組別。對(duì)CUDC-101處理的胚胎以及未經(jīng)處理胚胎進(jìn)行胚胎移植,移植到代孕母豬體內(nèi)。綜上所述,CUDC-101均可以顯著提高豬SCNT胚胎體內(nèi)及體外核重編程的發(fā)育能力。實(shí)驗(yàn)三：通過體細(xì)胞克隆方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)成為一種新方法,在本實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)u(píng)估了通過體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的效率,供體細(xì)胞采自2歲雌性五指山小型豬耳皮細(xì)胞,細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染三種不同抗病基因,分別為轉(zhuǎn)染豬γ干擾素(IFN-y)基因,抗口蹄疫病毒單鏈抗體基因(scFv)、豬IFN-y及抗口蹄疫病毒scFv融合基因(IS),與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞比較,作為供體細(xì)胞用于體細(xì)胞克隆。結(jié)果：(1)我們?cè)u(píng)估了當(dāng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分別作為供體時(shí)的胚胎的發(fā)育潛能,在卵裂率無顯著差異,分別為78.4%,79.5%,79.7%和80.6%,在隨后囊胚率上也無顯著差異,分別為10.8%,12.0%,11.4%和16.2%。(2)將轉(zhuǎn)有3種不同基因及非轉(zhuǎn)基因組的重構(gòu)胚分別被移植到27頭代孕母豬體內(nèi),其中19頭在胚胎移植后24-26天B超檢查中表現(xiàn)為妊娠,最終11頭代孕母豬分娩生產(chǎn)下67頭仔豬,仔豬出生一周后有25頭死亡,最終我們獲得了49頭存活克隆仔豬。經(jīng)比較,轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組在克隆仔豬成活率上并未有顯著性差異,分別為57.1%,52.6%,50.0%和66.6%(P0.05)。經(jīng)PCR基因分析,6頭表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。其中,5頭為scFv基因陽(yáng)性,1頭為IFN-y基因陽(yáng)性。結(jié)論,我們成功生產(chǎn)出轉(zhuǎn)有IFN-y和scFv基因的克隆五指山小型豬,與非轉(zhuǎn)基因克隆豬相比較,在卵裂率、囊胚率及產(chǎn)子率上均無顯著性差異,因此通過體細(xì)胞克隆方法可以作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的方法,并且不因?yàn)槭寝D(zhuǎn)基因動(dòng)物而降低生產(chǎn)效率。
【關(guān)鍵詞】：化學(xué)輔助去核法 成熟促進(jìn)因子 豬卵母細(xì)胞 組蛋白去乙�；敢种苿� CUDC-101 體細(xì)胞核移植 豬 IFN-γ scFv IS
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q813.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-18
• ABBREVIATIONS18-21
• CHAPTER 1 RESEARCH BACKGROUND21-42
• 1.1 Somatic cell nuclear transfer22-23
• 1.2 Dolly the sheep23-25
• 1.3 Cloning domestic animals from somatic cells25-27
• 1.4 The role of MPF meiotic maturation of oocyte27-29
• 1.5 Enucleation of the recipient oocyte29-34
• 1.6 Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following Nuclear Transfer34-36
• 1.7 Production of transgenic pigs36-41
• 1.8 Aim of this study41-42
• CHAPTER 2 EFFECT OF DEMECOLCINE-ASSISTED ENUCLEATION ON MPF LEVELSAND CYCLIN B1 DISTRIBUTION IN PORCINE OOCYTES42-66
• 2.1 Introduction43-44
• 2.2 Materials and Methods44-54
• 2.2.1 Source of reagents44-45
• 2.2.2 Main equipment45-46
• 2.2.3 Preparing Media and Materials46-47
• 2.2.4 Oocyte retrieval and in vitro maturation of oocytes47-48
• 2.2.5 Donor cell culture48-49
• 2.2.6 Nuclear transfer49-50
• 2.2.7 Embryo transfer50
• 2.2.8 MPF Assays50-51
• 2.2.9 Experimental design51-53
• 2.2.9.1 Experiment 1:Effects of DEM treatment on MPF levels in unenucleated MII oocytes51
• 2.2.9.2 Experiment 2:Effects of DEM treatment on MPF levels and the distribution of Cyclin B1 in oocytes51-52
• 2.2.9.3 Experiment 3:Enucleation efficiency and development of NT embryos in porcine oocytes enucleated by DEM-assisted or mechanical enucleation52-53
• 2.2.10 Statistical analysis53-54
• 2.3 Results54-62
• 2.3.1 Experiment 1:Effects of DEM treatment on MPF levels in MII oocytes54-55
• 2.3.2 Experiment 2:Effects of DEM treatment on the distribution of Cyclin B1 in oocytes55-58
• 2.3.3 Experiment 3:Enucleation efficiency and development of NT embryos in porcine oocytes by DEM-assisted enucleation or mechanical enucleation58-62
• 2.4 Discussion62-66
• CHAPTER 3 EFFECT OF CUDC-101 TREATMENT AFTER SOMATIC CELL NUCLEA66-74
• 3.1 Introduction67-68
• 3.2 Materials and methods68-69
• 3.2.1 In vitro-matured oocytes68
• 3.2.2 Isolation and culture of pig somatic cells68
• 3.2.3 Nuclear transfer68
• 3.2.4 Transfer of embryos and pregnancy determination68-69
• 3.2.5 Experimental design69
• 3.2.6 Statistical analysis69
• 3.3 Results69-72
• 3.4 Discussion72-74
• CHAPTER 4 PRODUCTION OF TRANSGENIC MINIATURE PIGLETS BY TRANSFEROF IFN-γ,SCFV AND IS GENE TRANSFECTED SOMATIC CELLS INTOENUCLEATED OOCYTES74-87
• 4.1 Introduction75-76
• 4.2 Materials and Methods76-80
• 4.2.1 Plasmids,chemicals and animals76-78
• 4.2.2 Donor cell cuture78
• 4.2.3 Transfection of resistance gene into ear fibroblasts78
• 4.2.4 Retrieval and vitro maturation of oocytes78
• 4.2.5 Nuclear transfer78
• 4.2.6 Embryo transfer78-79
• 4.2.7 Quality evaluation of embryos cultured in vitro79
• 4.2.8 Identification of positive clones79-80
• 4.2.9 Statistical analysis80
• 4.3 Results80-84
• 4.3.1 Embryo development following SCNT with nuclei obtained from IFN-γ transfected or non-transfected fibroblasts80
• 4.3.2 Generation of transgenic Wuzhishan miniature pigs80-84
• 4.4 Discussion84-87
• ACKNOWLEDGMENT87-90
• REFERENCES90-105
• PUBLICATION105-107

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 康錦丹;尹熙俊;趙明輝;梁爽;劉希;李文學(xué);崔成哲;;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)表達(dá)紅色熒光蛋白的豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2011年02期

  本文關(guān)鍵詞：體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)克隆豬及轉(zhuǎn)基因豬程序的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：350001