本文關(guān)鍵詞：Hnrnpk及Dnmts在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的表達(dá)及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：哺乳動物雄性生殖細(xì)胞發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程。這一過程受到體內(nèi)外多層次的精確調(diào)控,其中精子發(fā)生過程相關(guān)基因的正確表達(dá)對整個(gè)生精過程起著至關(guān)重要的作用。對這些基因在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的表達(dá)及相關(guān)功能的研究,將有助于我們深入闡明精子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)理,從而有針對性地為解決家畜繁殖障礙及雄性不育問題提供新的思路。異質(zhì)性胞核核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,Hnrnpk)作為一個(gè)多功能蛋白,廣泛參與了染色體包裝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、選擇性剪接和翻譯等過程,有著重要的生物學(xué)功能,與生殖細(xì)胞發(fā)育和精子發(fā)生關(guān)系密切。而精子發(fā)生過程伴隨著生殖細(xì)胞基因組DNA甲基化的重建,由DNA甲基化酶(DNA methyltransferases,Dnmts)介導(dǎo)的DNA甲基化異常會影響生殖細(xì)胞發(fā)育和精子發(fā)生。本研究選擇生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因Hnrnpk和Dnmts作為研究的切入點(diǎn),從克隆豬Hnrnpk基因著手,進(jìn)一步對其分子結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)定位模式、生物學(xué)功能展開系統(tǒng)研究并對其相關(guān)作用機(jī)理進(jìn)行了初步探索;同時(shí)建立了不同發(fā)育時(shí)期大鼠Dnmts的動態(tài)表達(dá)譜,并對其調(diào)控因素進(jìn)一步探尋;這些研究結(jié)果將為揭示其在精子發(fā)生過程中的重要作用奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下:(1)克隆得到豬的Hnrnpk基因,其c DNA全長為2712 bp,包含1392 bp的開放閱讀框,編碼463個(gè)氨基酸,起始密碼子位于230-232 bp處,終止密碼子位于1622-1624 bp處,5’端非翻譯區(qū)共229 bp,3’端非翻譯區(qū)共1091 bp。根據(jù)序列比對及基因結(jié)構(gòu)分析,推測出豬的Hnrnpk基因全長約為12.3 kb,包含17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子,該基因的外顯子與內(nèi)含子相連堿基符合GT/AG法則。通過RACE和進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)豬上至少存在8種不同的轉(zhuǎn)錄本,主要是由于外顯子1、8及17的選擇性剪接引起,且8種不同的轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)4種蛋白。(2)Hnrnpk在豬睪丸、骨骼肌及脂肪等組織中相對高表達(dá),肺、腎、卵巢及大腦等組織中次之,心和肝組織中表達(dá)相對較低;而在豬睪丸組織發(fā)育早期Hnrnpk表達(dá)量較高,這一結(jié)果在不同發(fā)育時(shí)期大鼠睪丸組織也得到進(jìn)一步驗(yàn)證。定位分布結(jié)果表明三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期豬睪丸組織曲細(xì)精管中Hnrnpk主要定位于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞胞核與精子細(xì)胞胞漿,在支持細(xì)胞和肌樣細(xì)胞也有分布。提示Hnrnpk可能在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。(3)設(shè)計(jì)并合成3對si RNA,轉(zhuǎn)染C18-4及GC-1spg細(xì)胞,篩選得到si RNA-1100干擾效率在80%以上。與si RNA-NC及Mock轉(zhuǎn)染組相比較,si RNA-Hnrnpk轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)量明顯減少,離散分布在視野中,且有較多漂浮細(xì)胞。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)及Cell Titer-Glo?細(xì)胞增殖檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組(P0.05),而凋亡檢測顯示TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組(P0.05);結(jié)果表明Hnrnpk的敲低減少了細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。(4)轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)敲低的GC-1spg差異表達(dá)的基因中24個(gè)基因與細(xì)胞增殖有關(guān),15個(gè)基因參與調(diào)控細(xì)胞凋亡。Icmt、Oaz1、Nanog、Fntb等正向調(diào)控增殖基因表達(dá)下調(diào),Nos2、Ptpn6、Serpine1、Spry1等負(fù)調(diào)控增殖的基因則表達(dá)上調(diào)。此外,Xiap、Rap1GAP1、Sirt1等抗凋亡基因表達(dá)下調(diào),Caspase2、Caspase3等促凋亡基因則表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明Hnrnpk可能通過調(diào)控上述增殖凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來發(fā)揮其生物學(xué)功能。(5)不同發(fā)育時(shí)期大鼠Dnmts的動態(tài)表達(dá)譜表明:在大鼠胚胎期睪丸組織中Dnmt3a表達(dá)量較高,其中在18.5胚齡達(dá)到最高水平,出生后逐漸降低,Dnmt3l的表達(dá)模式與Dnmt3a較為相似。而Dnmt3b出生前表達(dá)量較低,出生后逐漸升高。與Dnmt3相比,不同發(fā)育時(shí)期Dnmt1表達(dá)量相對較低,其表達(dá)趨勢與Dnmt3b相似。結(jié)果提示大鼠睪丸組織發(fā)育過程中,Dnmt3a與Dnmt3l可能相互協(xié)調(diào)在DNA甲基化重建過程發(fā)揮作用,而Dnmt3b與Dnmt1可能作用于DNA甲基化維持。(6)出生后不同發(fā)育時(shí)期大鼠mi R29的動態(tài)表達(dá)譜與Dnmt3a和Dnmt3b相反,mi R29 inhibitor轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)mi R29能夠負(fù)調(diào)控Dnmt3a和Dnmt3b。結(jié)果提示mi R29可能通過介導(dǎo)Dnmts在出生后大鼠睪丸組織發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。綜上所述,Hnrnpk在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá),并通過調(diào)控增殖與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)決定細(xì)胞的命運(yùn)。在大鼠睪丸組織發(fā)育過程中Dnmts呈現(xiàn)動態(tài)表達(dá)模式,Dnmt3a和Dnmt3l可能相互作用協(xié)調(diào)建立DNA甲基化模式,而Dnmt3b和Dnmt1可能參與DNA甲基化維持。同時(shí),在這個(gè)過程中mi R29可能通過負(fù)調(diào)控Dnmts的表達(dá)而發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：雄性生殖細(xì)胞 Dnmts Hnrnpk 表達(dá) 功能研究
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q954.4
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-36
• 1.1 哺乳動物雄性生殖生物學(xué)研究概況14-20
• 1.1.1 睪丸組織結(jié)構(gòu)及功能14-15
• 1.1.2 精子發(fā)生與生精上皮周期15-16
• 1.1.3 雄性生殖細(xì)胞發(fā)育16-17
• 1.1.4 精原干細(xì)胞17-20
• 1.2 Hnrnpk基因結(jié)構(gòu)及功能研究概況20-31
• 1.2.1 Hnrnpk蛋白結(jié)構(gòu)21-22
• 1.2.2 Hnrnpk的表達(dá)及調(diào)控22-23
• 1.2.3 Hnrnpk的翻譯后修飾23-24
• 1.2.4 Hnrnpk的生物學(xué)功能24-29
• 1.2.5 Hnrnpk與生殖發(fā)育29-31
• 1.2.6 展望31
• 1.3 精子發(fā)生過程中DNA甲基化的研究概況31-34
• 1.3.1 精子發(fā)生過程中DNA甲基化酶的研究概況33
• 1.3.2 精子發(fā)生過程中DNA甲基化酶調(diào)控的研究概況33-34
• 1.4 研究的目的與意義34-36
• 第二章 Hnrnpk基因的克隆及表達(dá)研究36-63
• 2.1 前言36
• 2.2 材料與方法36-48
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 2.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器37-38
• 2.2.3 主要化學(xué)藥品及試劑38
• 2.2.4 主要溶液配方38-40
• 2.2.5 豬Hnrnpk基因的克隆40-42
• 2.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR42-43
• 2.2.7 Western blotting分析43-45
• 2.2.8 免疫組織熒光分析45-46
• 2.2.9 載體構(gòu)建46-47
• 2.2.10 細(xì)胞培養(yǎng)47-48
• 2.2.11 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48
• 2.3 結(jié)果與分析48-60
• 2.3.1 總RNA的提取和檢測結(jié)果48-49
• 2.3.2 豬Hnrnpk基因的克隆和序列分析49-54
• 2.3.3 豬Hnrnpk基因及其缺失體的亞細(xì)胞定位54-55
• 2.3.4 豬Hnrnpk基因的時(shí)空表達(dá)分析55-56
• 2.3.5 Hnrnpk在不同發(fā)育階段豬睪丸組織中的表達(dá)及定位56-57
• 2.3.6 Hnrnpk在不同發(fā)育階段大鼠睪丸組織中的表達(dá)及定位57-60
• 2.4 討論60-63
• 第三章 Hnrnpk基因?qū)π∈缶?xì)胞增殖與生存的調(diào)節(jié)作用63-85
• 3.1 前言63
• 3.2 材料與方法63-70
• 3.2.1 材料63-64
• 3.2.2 主要方法64-66
• 3.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序66-70
• 3.3 結(jié)果與分析70-79
• 3.3.1 Hnrnpk在GC-1spg和C18-4 中的表達(dá)70
• 3.3.2 siRNA- Hnrnpk干擾效率檢測70
• 3.3.3 siRNA-Hnrnpk干擾后對GC-1spg細(xì)胞表型的影響70-72
• 3.3.4 siRNA- Hnrnpk干擾后對GC-1spg細(xì)胞增殖影響72-73
• 3.3.5 siRNA- Hnrnpk干擾后對GC-1spg細(xì)胞凋亡的影響73
• 3.3.6 siRNA- Hnrnpk干擾后細(xì)胞增殖分化凋亡相關(guān)基因檢測73-74
• 3.3.7 轉(zhuǎn)錄組測序74-79
• 3.4 討論79-85
• 第四章 雄性大鼠睪丸發(fā)育過程中Dnmts的表達(dá)研究85-95
• 4.1 前言85
• 4.2 材料與方法85-88
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料85
• 4.2.2 主要溶液配方85-86
• 4.2.3 miRNA29 inhibitor及探針合成86
• 4.2.4 主要方法86-88
• 4.3 結(jié)果與分析88-93
• 4.3.1 Dnmts在大鼠不同發(fā)育時(shí)期睪丸組織中mRNA水平的表達(dá)88-89
• 4.3.2 Dnmts在大鼠不同發(fā)育時(shí)期睪丸組織中蛋白水平的表達(dá)89
• 4.3.3 免疫組化檢測Dnmts在不同發(fā)育時(shí)期大鼠睪丸組織中的表達(dá)89-91
• 4.3.4 miR29 在不同發(fā)育時(shí)期大鼠睪丸組織中的表達(dá)91-92
• 4.3.5 miRNA29 inhibitor轉(zhuǎn)染GC-1spg細(xì)胞92-93
• 4.4 討論93-95
• 結(jié)論95-96
• 創(chuàng)新點(diǎn)96-97
• 下一步研究工作97-98
• 參考文獻(xiàn)98-114
• 附錄114-130
• 致謝130-131
• 作者簡介131

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 張明,盧克煥,盧晟盛;哺乳動物精子發(fā)生過程的基因表達(dá)[J];廣西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年03期

2 楊筱珍,陳耀星,王子旭,佘銳萍;基因?qū)π坌陨臣?xì)胞凋亡調(diào)控的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2004年01期

3 盧夏英;楊蓓;徐斯凡;鄒挺;;STRA8表達(dá)作為出生后雄性生殖細(xì)胞特異性標(biāo)志的應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J];中華男科學(xué)雜志;2010年02期

4 郭忠海;康現(xiàn)江;穆淑梅;孫婧;郭明申;;日本沼蝦雄性生殖細(xì)胞原代培養(yǎng)方法[J];動物學(xué)雜志;2007年01期

5 孫敏;施青青;李碧春;;胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為雄性生殖細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2012年01期

6 鄭金枝;王俊霞;朱寶長;;利用雄性生殖細(xì)胞建立轉(zhuǎn)基因動物的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2010年02期

7 ;小鼠雄性生殖細(xì)胞生后發(fā)育中的程序性死亡[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1999年03期

8 蔣爾鵬;轉(zhuǎn)化生長因子β超家族在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育中的作用[J];中華男科學(xué);2002年06期

9 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王蘭;;鎘對長江華溪蟹雄性生殖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[A];中國海洋與湖沼學(xué)會甲殼動物學(xué)分會、中國動物學(xué)會、中國海洋與湖沼學(xué)會生態(tài)學(xué)分會2000年學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2000年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 徐海霞;Hnrnpk及Dnmts在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的表達(dá)及功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 戴立勝;GRTH/DDX25通過調(diào)節(jié)睪丸特異miRNA-469控制雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育[D];吉林大學(xué);2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 潘少輝;小鼠胚胎干細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

2 張姍姍;miR-34c在小鼠胚胎干細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞分化過程中的作用[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

3 王芳;奶山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及向雄性生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：Hnrnpk及Dnmts在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的表達(dá)及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：345981