降鈣素（Calcitonin, CT）是由32個(gè)氨基酸殘基組成的多肽類激素,在體內(nèi)的主要作用是通過抑制破骨細(xì)胞活性,減少骨質(zhì)吸收,促進(jìn)鈣在骨中的沉積,從而降低血鈣濃度,被廣泛的使用于治療Paget綜合癥,骨質(zhì)疏松和高鈣血癥。研究表明,凍干的酵母作為多肽類藥物載體可以抵抗蛋白酶降解能力,降鈣素能夠以多肽的形式直接穿過動(dòng)物胃腸道的表皮細(xì)胞進(jìn)入血液。因此,本實(shí)驗(yàn)室的孫平楠和姜勇等人前期分別構(gòu)建了兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)鮭魚降鈣素基因酵母yAGA2-sCT和yAGA2-r-sCT,均成功實(shí)現(xiàn)了鮭魚降鈣素的口服給藥。為了進(jìn)一步提高降鈣素的表達(dá)量和生物活性,本研究將5拷貝人／鮭嵌合降鈣素基因（5hsCT）,以rDNA作為同源重組位點(diǎn)多拷貝整合到釀酒酵母基因組中,并對其的表達(dá)條件和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,通過動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行了安全性評價(jià),為實(shí)現(xiàn)口服降鈣素藥物生產(chǎn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究通過Hpal酶切表達(dá)載體pUC 18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA 1獲得線性rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNAI片段,以rDNA為同源重組位點(diǎn)將ura3標(biāo)記基因和帶有磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)... 

【文章來源】：中國海洋大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述和立項(xiàng)依據(jù)
    第一節(jié) 降鈣素的研究概況
        1 降鈣素的來源
            1.1 降鈣素的發(fā)現(xiàn)
            1.2 降鈣素的生產(chǎn)
        2 降鈣素的生物特性
            2.1 生物活性
            2.2 降鈣素的分子結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系
        3 hsCT分子的概況
            3.1 hsCT的分子結(jié)構(gòu)
            3.2 hsCT的等電點(diǎn)pI值、親水性和疏水性分析
            3.3 hsCT的抗原表位
        4 降鈣素的研究展望
    第二節(jié) 釀酒酵母rDNA的結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)整合影響因素的研究進(jìn)展
        1 釀酒酵母同源重組研究概況
        2 rDNA作為釀酒酵母同源重組位點(diǎn)的研究
        3 釀酒酵母rDNA序列元件組成及功能
            3.1 rDNA序列組成元件及功能
            3.2 rDNA序列35S啟動(dòng)子組成元件及功能
        4 影響釀酒酵母rDNA的因素
            4.1 影響rDNA的重要功能元件
            4.2 釀酒酵母rDNA重復(fù)單元拷貝數(shù)的影響因素
            4.3 釀酒酵母rDNA重復(fù)單元穩(wěn)定性的影響因素
            4.4 以rDNA高拷貝數(shù)整合的外源基因在有絲分裂中穩(wěn)定性的影響因素
        5 展望
    第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因食品的安全性評價(jià)研究
        1 轉(zhuǎn)基因食品的概況
        2 轉(zhuǎn)基因食品的安全問題
        3 轉(zhuǎn)基因食品的安全性評價(jià)
            3.1 營養(yǎng)評價(jià)
            3.2 致敏性檢測
            3.3 毒理學(xué)評價(jià)
        4 食品安全性評價(jià)的應(yīng)用
            4.1 食品安全性評價(jià)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用
            4.2 食品安全性評價(jià)在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用
            4.3 食品安全性評價(jià)在轉(zhuǎn)基因微藻中的應(yīng)用
            4.4 食品安全性評價(jià)在轉(zhuǎn)基因酵母中的應(yīng)用
    第四節(jié) 立項(xiàng)依據(jù)
        1 5hsCT基因的構(gòu)建及表達(dá)研究
        2 以rDNA介導(dǎo)降鈣素基因在釀酒酵母中的表達(dá)
        3 人/鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因在釀酒酵母中表達(dá)
第二章 轉(zhuǎn)5hsCT基因釀酒酵母的檢測分析
    第一節(jié) 5hsCT基因向釀酒酵母的轉(zhuǎn)化和檢測
        1 前言
        2 材料
            2.1 質(zhì)粒和菌株
            2.2 培養(yǎng)基
            2.3 常用試劑
            2.4 主要儀器設(shè)備
        3 方法
            3.1 rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1線性片段的獲得
            3.2 釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
            3.3 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化操作
            3.4 轉(zhuǎn)化子的篩選和遺傳穩(wěn)定性檢測
            3.5 提取轉(zhuǎn)基因釀酒酵母基因組DNA
            3.6 Southern blotting實(shí)驗(yàn)
        4 結(jié)果
            4.1 rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1線性片段的獲得
            4.2 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的篩選和穩(wěn)定性檢測
            4.3 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的Southem blotting檢測
        5 討論
            5.1 各種因素對轉(zhuǎn)化率的影響
            5.2 轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性的影響因素
            5.3 Southern blotting檢測
    第二節(jié) 人/鮭嵌合降鈣素在釀酒酵母中表達(dá)的定性和定量分析
        1 前言
        2 材料
            2.1 菌種
            2.2 溶液及試劑
            2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3 方法
            3.1 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的培養(yǎng)
            3.2 釀酒酵母總蛋白的提取
            3.3 可溶性總蛋白質(zhì)含量的測定
            3.4 SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳
            3.5 Western Blotting
            3.6 免疫檢測
            3.7 酶聯(lián)免疫吸附測定
        4 結(jié)果
            4.1 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT總蛋白含量的測定
            4.2 人/鮭嵌合降鈣素的表達(dá)與定性分析
            4.3 人/鮭嵌合降鈣素的表達(dá)與定量分析
        5 討論
            5.1 Western blotting結(jié)果分析
            5.2 ELISA結(jié)果分析
    第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠的降血鈣活性研究
        1 前言
        2 材料
            2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            2.2 實(shí)驗(yàn)菌株
            2.3 培養(yǎng)基
            2.4 常用實(shí)驗(yàn)儀器
        3 方法
            3.1 釀酒酵母的培養(yǎng)
            3.2 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的收集
            3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
            3.4 小鼠取血和血清的制備
            3.5 血鈣值的檢測
            3.6 統(tǒng)計(jì)方法
        4 結(jié)果
            4.1 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠狀態(tài)的影響
            4.2 小鼠血鈣值的數(shù)據(jù)處理
            4.3 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT的持續(xù)降血鈣活性
            4.4 劑量效應(yīng)
        5 討論
            5.1 真空冷凍干燥對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的影響
            5.2 取血方法對血清的影響
            5.3 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的降血鈣活性效果
第三章 5hsCT在轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT中表達(dá)條件的優(yōu)化
    第一節(jié) 不同條件對5hsCT基因在轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT中表達(dá)的影響
        1 前言
        2 材料
            2.1 菌株與培養(yǎng)基
            2.2 主要試劑
            2.4 主要儀器
        3 方法
            3.1 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母種子液的培養(yǎng)
            3.2 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母培養(yǎng)的時(shí)間梯度設(shè)置
            3.3 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母培養(yǎng)的溫度梯度設(shè)置
            3.4 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速梯度設(shè)置
            3.5 釀酒酵母總RNA的提取
            3.7 Real-time PCR
            3.8 基因相對表達(dá)量的數(shù)據(jù)處理
            3.9 酵母總蛋白的提取
            3.10 可溶性總蛋白質(zhì)含量的測定
            3.11 SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳
            3.12 酶聯(lián)免疫吸附測定
        4 結(jié)果與分析
            4.1 不同條件處理后釀酒酵母總RNA的提取
            4.2 Real-time PCR反應(yīng)
            4.3 不同條件下5hsCT在釀酒酵母中表達(dá)的SDS-PAGE分析
            4.4 不同條件下人/鮭嵌合降鈣素的ELISA測定
        5 討論
            5.1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對Realtime PCR的影響因素
            5.2 不同條件對5hsCT基因在釀酒酵母中表達(dá)的影響
    第二節(jié) 單因子實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT培養(yǎng)條件的優(yōu)化
        1 前言
        2 材料
            2.1 菌株與培養(yǎng)基
            2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            2.3 主要儀器
        3 方法
            3.1 種子液的制備
            3.2 接種量和發(fā)酵時(shí)間對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
            3.3 溫度對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
            3.4 攪拌轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
            3.5 通氣比對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
            3.6 酵母細(xì)胞密度及比生長速率的測定
            3.7 酵母生物量的測定
        4 結(jié)果與分析
            4.1 發(fā)酵時(shí)間對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT生長的影響
            4.2 接種量對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
            4.3 溫度對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
            4.4 攪拌轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
            4.5 通氣量對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
        5 討論
            5.1 發(fā)酵時(shí)間和初始接種量對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
            5.2 發(fā)酵溫度對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
            5.3 發(fā)酵攪拌速度和通氣量對轉(zhuǎn)基因釀酒酵母生長的影響
    第三節(jié) 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對5hsCT在釀酒酵母YS-5hsCT中表達(dá)條件的綜合優(yōu)化
        1 前言
        2 材料
            2.1 菌株和培養(yǎng)基
            2.2 常用儀器
        3 方法
            3.1 種子液的制備
            3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
            3.3 酵母總蛋白的提取
            3.4 可溶性總蛋白質(zhì)含量的測定
            3.5 SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳
            3.6 酶聯(lián)免疫吸附測定
            3.7 酵母生物量的測定
        4 結(jié)果與分析
            4.1 正交實(shí)驗(yàn)中5hsCT蛋白表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果分析
            4.2 正交實(shí)驗(yàn)中5hsCT蛋白產(chǎn)量的結(jié)果分析
        5 討論
第四章 小鼠口服轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT的安全性評價(jià)
    第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)
        1 前言
        2 材料
            2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            2.2 動(dòng)物飼料
            2.3 菌株
        3 方法
            3.1 實(shí)驗(yàn)分組
            3.2 實(shí)驗(yàn)記錄
            3.3 LDso的計(jì)算公式
        4 結(jié)果
        5 討論
    第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT的致突變作用研究Ⅰ
        1 前言
        2 材料
            2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、飼料和菌株
            2.2 主要試劑
            2.3 主要儀器
        3 方法
            3.1 實(shí)驗(yàn)分組
            3.2 制作小鼠骨髓細(xì)胞涂片
            3.3 涂片鏡檢
            3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4 結(jié)果
        5 討論
    第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的致突變作用研究Ⅱ
        1 前言
        2 材料
            2.1 動(dòng)物、飼料和菌株
            2.2 主要試劑
            2.3 主要儀器
        3 方法
            3.1 實(shí)驗(yàn)分組
            3.2 制作小鼠精子涂片
            3.3 精子畸形檢查
            3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4 結(jié)果
            4.1 釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠精子畸形的誘導(dǎo)作用
            4.2 小鼠精子的畸形類型檢查
        5 討論
    第四節(jié) 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT的致畸變作用研究
        1 前言
        2 材料
            2.1 動(dòng)物、飼料和菌株
            2.2 主要試劑
            2.3 主要儀器
        3 方法
            3.1 實(shí)驗(yàn)分組
            3.2 孕鼠的生殖機(jī)能檢查
            3.3 胎鼠的外觀檢查
            3.4 胎鼠骨骼標(biāo)本的制作與檢查
            3.5 胎鼠內(nèi)臟的畸形檢查
            3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析
        4 結(jié)果
            4.1 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠的母體毒性
            4.2 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠的胚胎發(fā)育毒性
            4.3 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT對胎鼠外觀的致畸影響
            4.4 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT對胎鼠骨骼的致畸影響
            4.5 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT對胎鼠各器官、內(nèi)臟的致畸影響
        5 討論
    第五節(jié) 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠的30天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究
        1 前言
        2 材料
            2.1 動(dòng)物、飼料和菌株
            2.2 主要試劑
            2.3 主要儀器
        3 方法
            3.1 實(shí)驗(yàn)分組
            3.2 血液學(xué)和血液生化檢查
            3.3 病理組織學(xué)檢查
            3.4 冰凍切片的制備
            3.5 冰凍切片的蘇木素伊紅染色
            3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4 結(jié)果
            4.1 一般觀察
            4.2 釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠體重的影響
            4.3 釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響
            4.4 釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠血液生化指標(biāo)的影響
            4.5 釀酒酵母YS-5hsCT對小鼠臟器系數(shù)的影響
            4.6 病理組織檢查
        5 討論
            5.1 血常規(guī)和血液生化檢測
            5.2 體重變化和臟器系數(shù)的影響
        6 小結(jié)
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
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【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3436472