豬德爾塔冠狀病毒免疫應答的初步評價及感染LLC-PK細胞的蛋白質(zhì)組學分析
發(fā)布時間：2021-07-20 22:56
豬德爾塔冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一種新型的豬腸道冠狀病毒,可感染不同日齡豬,但新生仔豬更易感,感染后主要表現(xiàn)出嚴重腹瀉、嘔吐、脫水等臨床癥狀。2012年,在中國香港首次報道了PDCoV。然而,PDCoV疫情的爆發(fā)卻發(fā)生在2014年美國俄亥俄州。隨后,在美國養(yǎng)豬州迅速蔓延和傳播,造成新生仔豬3040%的死亡率。近年來,PDCoV已在多個國家豬場中流行,包括中國、加拿大、日本、韓國、泰國、墨西哥等國家。當前,由于尚不清楚PDCoV傳播和致病機制,并且缺乏有效的疫苗和防控措施,給多個國家造成了巨大的經(jīng)濟損失,對養(yǎng)豬業(yè)仍然是一個嚴峻的挑戰(zhàn)�；诖�,本研究對PDCoV開展以下幾方面的研究,以期為提高PDCoV快速診斷、闡明致病機制和疫苗的研發(fā)等奠定基礎。1.PDCoV LFD-RPA快速檢測方法的建立參照GenBank中已公布的PDCoV N基因保守序列（GenBank登入號:KJ481931）設計特異性引物和探針,建立重組酶聚合酶擴增結(jié)合側(cè)流層析試紙條（Recombinase polymerase amplificatio...
【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學甘肅省
【文章頁數(shù)】：118 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
PDCoV基因組結(jié)構(gòu)示意圖[2,19]
甘肅農(nóng)業(yè)大學2020屆博士學位論文8結(jié)果顯示沒有呼吸道相關組織感染的跡象，因此發(fā)生氣溶膠傳播的機制可能是通過糞便-口腔途徑攝入氣溶膠病毒[82]。盡管糞便-口腔途徑是PDCoV傳播的主要方式，但其傳播能力取決于豬接種劑量和年齡[83]。與PEDV傳播相似，PDCoV感染豬腹瀉糞便和/或嘔吐物和其它受污染的食物或載體，如受污染的運輸車輛、飼料和飼料箱可能是病毒的主要傳播源[84,85]。此外，另一個主要的傳播源是PDCoV攜帶者，如處于亞臨床癥狀的感染母豬和斷奶仔豬，它們通常沒有明顯的臨床癥狀，卻往往容易被忽略。因此，美國農(nóng)業(yè)部強調(diào)PDCoV疾病控制措施中包括劃定外部來源和農(nóng)場之間的隔離線，清潔和消毒谷倉和設備，確保替代動物為陰性，加強人員以及運輸車輛的生物安全程序。有研究表明，PDCoV可能是利用氨基肽酶（AminopeptidseN,APN）保守區(qū)域感染多種物種的細胞系，以促進其在不同物種間傳播，包括豬、小牛和雞[46,86,87]�；赟和N基因序列分析，PDCoV與亞洲豹貓的CoVs基因最為相似。目前，還不清楚δ冠狀病毒是如何在小型哺乳動物（如亞洲豹貓和中國雪貂獾）和家豬之間傳播的。Woo等[2]提出了以蝙蝠為α和β冠狀病毒基因來源宿主，鳥類是γ和δ冠狀病毒基因來源宿主的CoV進化模型。由于PDCoV是一種潛在的人畜共患病原體，對其在人類中流行及其對人類疾病影響的研究仍在繼續(xù)[87]。當然，對PDCoV有效的治療方法和疫苗的研發(fā)才是阻止其傳播和感染的關鍵手段。圖1-2PDCoV引進和傳播途徑[80]Fig.1-2IntroductionandtransmissionofPDCoV
豬德爾塔冠狀病毒免疫應答的初步評價及感染LLC-PK細胞的蛋白質(zhì)組學分析21圖1-3基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學實驗流程Fig.1-3Experimentalflowofproteomicsbasedonmassspectrometry5.2蛋白質(zhì)組學在冠狀病毒研究中的應用近年來，蛋白質(zhì)組學技術常作為檢測蛋白質(zhì)間的相互作用、蛋白質(zhì)差異表達譜、蛋白質(zhì)動力學和蛋白復雜調(diào)控機制的有效工具[118,119]。此外，隨著生物信息學和質(zhì)譜技術的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學中大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的有效性和速度得到顯著的提高，這使得蛋白質(zhì)組學越來越廣泛應用于病毒學的研究中，如PEDV、TGEV、SADS-CoV、流感病毒（influenzavirus）和口蹄疫病毒（footandmouthdiseasevirus）[120-124]。病毒感染可引起宿主細胞蛋白表達水平變化，從而影響宿主細胞的正常生理功能，并決定病毒的致病性。因此，蛋白質(zhì)組學技術為研究宿主與病毒之間的相互作用提供了一種有效的途徑，利用蛋白質(zhì)組學技術研究病毒感染后蛋白差異表達譜有助于進一步揭示病毒與宿主細胞的相互作用及其致病機制[125]。通常來說，冠狀病毒感染宿主細胞主要引起轉(zhuǎn)錄模式、細胞周期、細胞骨架、凋亡途徑、免疫系統(tǒng)和應激反應的改變，并可能引起炎癥反應[126]。Chen等[127]分別從PEDV感染和未感染新生仔豬中分離出血清外泌體，進而應用Label-free結(jié)合LC-MS/MS定量蛋白質(zhì)組學技術分析蛋白差異表達譜。與未感染血清外泌體相比，PEDV感染組外泌體血清中共鑒定出89個差異表達蛋白（Differentiallyexpressedproteins,DEPs），有10個補體蛋白存在于PEDV感染豬血清外泌體中，
本文編號：3293766
【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學甘肅省
【文章頁數(shù)】：118 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
PDCoV基因組結(jié)構(gòu)示意圖[2,19]
甘肅農(nóng)業(yè)大學2020屆博士學位論文8結(jié)果顯示沒有呼吸道相關組織感染的跡象，因此發(fā)生氣溶膠傳播的機制可能是通過糞便-口腔途徑攝入氣溶膠病毒[82]。盡管糞便-口腔途徑是PDCoV傳播的主要方式，但其傳播能力取決于豬接種劑量和年齡[83]。與PEDV傳播相似，PDCoV感染豬腹瀉糞便和/或嘔吐物和其它受污染的食物或載體，如受污染的運輸車輛、飼料和飼料箱可能是病毒的主要傳播源[84,85]。此外，另一個主要的傳播源是PDCoV攜帶者，如處于亞臨床癥狀的感染母豬和斷奶仔豬，它們通常沒有明顯的臨床癥狀，卻往往容易被忽略。因此，美國農(nóng)業(yè)部強調(diào)PDCoV疾病控制措施中包括劃定外部來源和農(nóng)場之間的隔離線，清潔和消毒谷倉和設備，確保替代動物為陰性，加強人員以及運輸車輛的生物安全程序。有研究表明，PDCoV可能是利用氨基肽酶（AminopeptidseN,APN）保守區(qū)域感染多種物種的細胞系，以促進其在不同物種間傳播，包括豬、小牛和雞[46,86,87]�；赟和N基因序列分析，PDCoV與亞洲豹貓的CoVs基因最為相似。目前，還不清楚δ冠狀病毒是如何在小型哺乳動物（如亞洲豹貓和中國雪貂獾）和家豬之間傳播的。Woo等[2]提出了以蝙蝠為α和β冠狀病毒基因來源宿主，鳥類是γ和δ冠狀病毒基因來源宿主的CoV進化模型。由于PDCoV是一種潛在的人畜共患病原體，對其在人類中流行及其對人類疾病影響的研究仍在繼續(xù)[87]。當然，對PDCoV有效的治療方法和疫苗的研發(fā)才是阻止其傳播和感染的關鍵手段。圖1-2PDCoV引進和傳播途徑[80]Fig.1-2IntroductionandtransmissionofPDCoV
豬德爾塔冠狀病毒免疫應答的初步評價及感染LLC-PK細胞的蛋白質(zhì)組學分析21圖1-3基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學實驗流程Fig.1-3Experimentalflowofproteomicsbasedonmassspectrometry5.2蛋白質(zhì)組學在冠狀病毒研究中的應用近年來，蛋白質(zhì)組學技術常作為檢測蛋白質(zhì)間的相互作用、蛋白質(zhì)差異表達譜、蛋白質(zhì)動力學和蛋白復雜調(diào)控機制的有效工具[118,119]。此外，隨著生物信息學和質(zhì)譜技術的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學中大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的有效性和速度得到顯著的提高，這使得蛋白質(zhì)組學越來越廣泛應用于病毒學的研究中，如PEDV、TGEV、SADS-CoV、流感病毒（influenzavirus）和口蹄疫病毒（footandmouthdiseasevirus）[120-124]。病毒感染可引起宿主細胞蛋白表達水平變化，從而影響宿主細胞的正常生理功能，并決定病毒的致病性。因此，蛋白質(zhì)組學技術為研究宿主與病毒之間的相互作用提供了一種有效的途徑，利用蛋白質(zhì)組學技術研究病毒感染后蛋白差異表達譜有助于進一步揭示病毒與宿主細胞的相互作用及其致病機制[125]。通常來說，冠狀病毒感染宿主細胞主要引起轉(zhuǎn)錄模式、細胞周期、細胞骨架、凋亡途徑、免疫系統(tǒng)和應激反應的改變，并可能引起炎癥反應[126]。Chen等[127]分別從PEDV感染和未感染新生仔豬中分離出血清外泌體，進而應用Label-free結(jié)合LC-MS/MS定量蛋白質(zhì)組學技術分析蛋白差異表達譜。與未感染血清外泌體相比，PEDV感染組外泌體血清中共鑒定出89個差異表達蛋白（Differentiallyexpressedproteins,DEPs），有10個補體蛋白存在于PEDV感染豬血清外泌體中，
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