塞內(nèi)卡病毒（Seneca Valley virus,SVV）,在遺傳上與小RNA病毒科、心病毒屬病毒關系相近,臨床上能引起豬的鼻吻、蹄冠狀帶部位出現(xiàn)水皰樣病變,偶見腹瀉癥狀,病情急促,新生仔豬病死率高,我國現(xiàn)已出現(xiàn)多省份豬場感染SVV的病例,豬群感染SVV后表現(xiàn)的臨床癥狀與口蹄疫、豬水皰病、水泡性口炎、豬水泡疹等病毒感染后癥狀非常相似,在臨床癥狀上常常引起混淆。如果未能對以上幾種疫病及時作出準確的鑒別診斷,將導致防控措施采取不當,養(yǎng)殖成本大大提高。在我國,2016年首次分離到了SVV。國內(nèi)外對SVV感染的實驗室檢測已經(jīng)開發(fā)了電子顯微鏡、免疫組化、RT-PCR等檢測方法。數(shù)字PCR（dPCR）技術作為建立在qPCR檢測方法的基礎上的核酸絕對定量的新技術,與此前發(fā)展起來的qPCR核酸相對定量方法比較,其定量方法更加靈敏和準確度更高,而且不需要建立標準曲線可直接判斷結(jié)果。核酸標準物質(zhì)是驗證SVV檢測方法、檢測試劑是否科學、可靠的關鍵,也是實驗室質(zhì)量控制的重要手段,因此核酸標準物質(zhì)的研制可為精準化疫病防控提供技術保障。國內(nèi)針對塞內(nèi)卡病毒檢測方法的標準物質(zhì)十分匱乏,各級檢測機構(gòu)缺少核酸標準物質(zhì)。... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學甘肅省

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

FMDVRT-PCR擴增Fig.2-1RT-PCRamplificationofFMDV

塞內(nèi)卡病毒qPCR、ddPCR方法的建立及標準物質(zhì)的制備研究13圖2-1FMDVRT-PCR擴增Fig.2-1RT-PCRamplificationofFMDV注：M．蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；１.FMDV擴增條帶Note:M.proteinrelativemolecularmassstandard;1.FMDVamplificationband圖2-2SVVRT-PCR擴增Fig.2-2RT-PCRamplificationofSVV注：M．蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；１.SVV擴增條帶Note:M.proteinrelativemolecularmassstandard;1.SVVamplificationband2.2FMDV/SVV二重qPCR反應條件的優(yōu)化優(yōu)化的25μLPCR反應體系中，F(xiàn)MDV/SVVP1/P2、P3/P4終濃度各0.4μmol/L，Probe-P5終濃度為0.6μmol/L，Probe-P6終濃度為0.7μmol/L，2.5mmol/LdNTPs2μL，10×ExTaq酶緩沖液2.5μL，5U/μLExTaqDNA酶0.25μL，1.0×105拷貝/μL的cDNA模板各2μL，補足去離子水至終體積25μL。優(yōu)化的PCR反應程序為：94℃，5min；94℃15s，60℃30s，40個循環(huán)。結(jié)果判定：陰性對照的檢測結(jié)果應無特定的擴增曲線，且Ct值＞33.0或無，陽性對照的Ct值應≤30.0，且出現(xiàn)特定的擴增曲線，判定檢測結(jié)果成立。在檢測結(jié)果成立的前提下，若樣品檢測結(jié)果Ct值≤30.0，而且出現(xiàn)特定的擴增曲線，判定為陽性；Ct值＞33.0或無，并且無特定的擴增曲線，則判定為陰性；30.0＜Ct值≤33.0且有特定擴增曲線的樣品判定為可疑，擴增曲線如圖所示。

甘肅農(nóng)業(yè)大學2015屆獸醫(yī)博士學位論文14圖2-3FMDV/SVV二重qPCR的擴增曲線Fig.2-3ThekineticcurvefordoubleqPCRofFMDV-T/FMDV-A注：1.FMDV陽性對照；2.SVV陽性對照；3，陰性對照Note:1.FMDpositivecontrol；2.FMD/Apositivecontrol；3-4.Negativecontro2.3敏感性試驗二重qPCR檢測FMDV和SVV最低檢出限均為1.0×101拷貝/μL，101～106拷貝/μL模板范圍內(nèi)的擴增曲線有很好的線性關系，如圖所示。圖2-4FMDV敏感性試驗結(jié)果Fig.2-4SensitivitytestforFMDVqPCR注：1～7.1.0×106～1.0拷貝/μL的FMDVcDNA；8.陰性對照Note:1～7.ReprecentsFMDVcDNAwas1.0×106-1.0copies/μLrespectively；8.Negativecontrol

【參考文獻】：
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