異化金屬還原菌（Dissimilatory Metal Reducing Bacteria,DMRB）是一類能利用胞外金屬氧化物進行呼吸并儲存能量用于生長、代謝的微生物,其底物代謝產生的電子通常需要經過復雜的電子傳遞網(wǎng)絡才能傳遞給胞外電子受體。除金屬氧化物外,DMRB還可以將電子傳遞給金屬離子、電極以及多種污染物。因此,它們在重金屬（包括放射性核素）去除、生態(tài)修復和能源回收中具有巨大的應用價值。但是,較低的胞外電子傳遞（Extracellular Electron Transfer,EET）效率是目前制約DMRB在生態(tài)修復和能源生產等領域應用的主要瓶頸之一。本論文以Shewanella oneidensis MR-1為底盤微生物,以強化其胞外電子傳遞能力為目標,研發(fā)了一體化CRISPR平臺、基因網(wǎng)絡集成策略、新型基因組編輯工具、無抗生素基因載體等多種基因工程技術�；谶@些技術,繼而探究了基因組EET途徑的重構和優(yōu)化對污染物生物降解的強化作用,以及復雜EET基因網(wǎng)絡對電子傳遞的提升作用,并為S.oneidensis進行生態(tài)修復提供了科學依據(jù)。本文的研究內容和主要結果如下:1.S.onei... 

【文章來源】：中國科學技術大學安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：160 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 引言
    1.2 異化金屬還原模式菌-DMRB
        1.2.1 Shewanella屬
        1.2.2 Shewanella oneidensis MR-1
    1.3 DMRB的生物學研究
        1.3.1 DMRB的環(huán)境分布和功能
        1.3.2 DMRB的分子生物學研究
    1.4 DMRB的胞外電子傳遞
        1.4.1 NADH池和甲基萘醌類池
        1.4.2 依賴于細胞色素c的直接電子傳遞
        1.4.3 依賴于納米導線的電子傳遞
        1.4.4 依賴于電子穿梭體的間接電子傳遞
    1.5 基因編輯技術
        1.5.1 基因編輯技術的發(fā)展
        1.5.2 基因編輯技術的類型
        1.5.3 基因編輯技術在環(huán)境功能微生物中的應用
    1.6 本文研究的主要內容,目的和意義
        1.6.1 研究內容
        1.6.2 研究目的和意義
    參考文獻
第二章 S.oneidensis MR-1胞外電子傳遞鏈的CRISPR-Cas9基因編輯
    2.1 概述
    2.2 材料和方法
        2.2.1 巢湖底泥基因豐度和群落結構測定
        2.2.2 菌株、質粒及培養(yǎng)條件
        2.2.3 E.coli電轉感受態(tài)的制備
        2.2.4 基因操作、質粒構建和轉移
        2.2.5 GFP-lacZ報告菌株的構建
        2.2.6 “易編輯型”CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構建和基因編輯操作流程
        2.2.7 細胞色素c、黃素和NADH的測定方法
        2.2.8 表達基因的定量PCR
        2.2.9 電化學實驗方法
        2.2.10 U(Ⅵ)還原實驗及產物表征方法
    2.3 結果與討論
        2.3.1 功能微生物在巢湖底泥中的分布特征
        2.3.2 借助CRISPR-Cas9開發(fā)增強EET能力的CRISPR-GPS
        2.3.3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在S.oneidensis中的效率評估
        2.3.4 基于CRISPR-GPS的胞外電子傳遞網(wǎng)絡的基因編輯
        2.3.5 編輯菌株的生物學特性和電化學特征
        2.3.6 編輯菌株增強U(Ⅵ)還原
    2.4 小結
    參考文獻
第三章 S.oneidensis MR-1胞外電子傳遞基因網(wǎng)絡平臺的構建和應用
    3.1 概述
    3.2 材料和方法
        3.2.1 菌株、質粒及培養(yǎng)條件
        3.2.2 E.coli電轉感受態(tài)制備及質粒的構建和轉移
        3.2.3 基于Int因子的基因網(wǎng)絡平臺的構建
        3.2.4 依賴于CRISPR-Cas9_((3.7))系統(tǒng)的基因編輯
        3.2.5 細胞色素c和黃素的測定方法
        3.2.6 表達基因的定量PCR
        3.2.7 電化學實驗方法
    3.3 結果與討論
        3.3.1 DMRB基因網(wǎng)絡平臺的構建
        3.3.2 基因網(wǎng)絡平臺整合-環(huán)化效率的評估
        3.3.3 細胞色素c途徑的啟動子重構和黃素合成途徑的快速整合
        3.3.4 工程菌株的生物學特性
        3.3.5 工程菌株的產電能力強化
    3.4 小結
    參考文獻
第四章 S.oneidensis MR-1胞外電子傳遞鏈I-SceI-RecET的基因編輯
    4.1 概述
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株、質粒及培養(yǎng)條件
        4.2.2 coli電轉感受態(tài)制備及質粒的構建和轉移
        4.2.3 基因操作及藍白斑篩選實驗
        4.2.4 細胞色素c和吩嗪的測定方法
        4.2.5 異源基因表達的定量PCR
        4.2.6 電化學測試方法
        4.2.7 污染物還原實驗
    4.3 結果與討論
        4.3.1 iEditing基因編輯工具的設計和構建
        4.3.2 編輯工具在S.oneidensis中的驗證
        4.3.3 偶聯(lián)重組系統(tǒng)提高基因組編輯效率
        4.3.4 在S.oneidensis中重構額外的EET途徑
        4.3.5 編輯菌株的生物學和電化學特性
        4.3.6 編輯菌株強化污染物還原
        4.3.7 編輯工具在其他革蘭氏陰性菌中的應用
    4.4 小結
    參考文獻
第五章 S.oneidensis MR-1中不依賴于抗生素遺傳操作平臺的設計和建立
    5.1 概述
    5.2 材料和方法
        5.2.1 菌株、質粒及培養(yǎng)條件
        5.2.2 E.coli電轉感受態(tài)制備及質粒構建和轉移
        5.2.3 基因操作及質粒穩(wěn)定性的測定
        5.2.4 細胞色素c和甲基萘醌的測定
        5.2.5 基因表達的定量PCR
        5.2.6 電化學測試方法
        5.2.7 污染物的還原實驗
    5.3 結果與討論
        5.3.1 基于I-SceI的S.oneidensis MR-1大質粒消除
        5.3.2 基于內源質粒復制起始因子的質粒平臺構建
        5.3.3 不依賴于抗生素工程菌株的構建
        5.3.4 細胞色素c和甲基萘醌過表達菌株的構建與表征
        5.3.5 強化染料和重金屬還原
    5.4 小結
    參考文獻
結論
致謝
在讀期間發(fā)表的學術論文



本文編號：3193601