本文關(guān)鍵詞：PKC誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻誘發(fā)的巨噬細(xì)胞噬紅細(xì)胞作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人紅細(xì)胞的平均壽命為100~120天,正常人體內(nèi)大約存在3×1013個紅細(xì)胞。每天,有超過2×1011個紅細(xì)胞被替換。紅細(xì)胞在體內(nèi)經(jīng)歷成熟、衰老,最終被脾、肝、骨髓等處的巨噬細(xì)胞吞噬、分解。而且老化或者疾病的紅細(xì)胞往往呈現(xiàn)較弱的細(xì)胞形變以及形變恢復(fù)能力,使之易于被脾臟滯留,從而被吞噬細(xì)胞吞噬以及消化。巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的識別主要通過其表面的受體來進(jìn)行的。成熟哺乳動物的紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核以及細(xì)胞器等,紅細(xì)胞膜的異常(如帶3蛋白交聯(lián),錨蛋白外翻)觸發(fā)了巨噬細(xì)胞表面的受體分子與其識別,接著黏附、吞噬和分解。然而,膜蛋白的異常導(dǎo)致的紅細(xì)胞過早清除或者凋亡障礙與多種血液疾病相關(guān),如膜蛋白缺陷、阿爾茨海默癥以及高原紅細(xì)胞增多癥。同樣在血液保存中,膜蛋白的異常與否往往與血液保存時間的長短有關(guān)。探其根源,紅細(xì)胞膜蛋白的異常以及紅細(xì)胞程序性死亡與紅細(xì)胞胞內(nèi)的PKC激活密切相關(guān)。因此,本文通過PMA激活紅細(xì)胞胞內(nèi)的PKC,從而探討激活的PKC與紅細(xì)胞錨蛋白外翻的關(guān)系以及誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻的機(jī)制問題,也進(jìn)一步探索了激活的PKC誘導(dǎo)紅細(xì)胞膜骨架結(jié)合親和力的變化與紅細(xì)胞形變能力的相關(guān)關(guān)系。希望為深入了解紅細(xì)胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)以及治療膜蛋白異常的相關(guān)血液疾病,同時也對研究人工紅細(xì)胞的膜骨架蛋白與紅細(xì)胞變形性能、血液保存過程中血液保存時間的延長等提供細(xì)胞和分子層面的探索機(jī)理。紅細(xì)胞錨蛋白為膜內(nèi)在蛋白,只有當(dāng)錨蛋白外翻到細(xì)胞膜的外側(cè)且錨蛋白RGD序列端也暴露在細(xì)胞表面時,巨噬細(xì)胞表面的受體分子整合素αvβ3才能與之識別、黏附和吞噬。本研究論文通過PMA激活紅細(xì)胞胞內(nèi)的PKC來判斷與紅細(xì)胞程序性死亡緊密相關(guān)的胞內(nèi)PKC的激活能否誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白的外翻。結(jié)果表明,激活的PKC能夠誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻到紅細(xì)胞膜外側(cè),然而錨蛋白外翻的紅細(xì)胞的比例呈PMA濃度依賴關(guān)系,而且錨蛋白外翻的紅細(xì)胞的比例體現(xiàn)出血液捐獻(xiàn)者的個體差異性。這意味著盡管PMA誘導(dǎo)PKC的激活能夠促使紅細(xì)胞錨蛋白的外翻,但是錨蛋白外翻的紅細(xì)胞的比例與胞內(nèi)游離的PKC對PMA的敏感性以及紅細(xì)胞胞內(nèi)PKC活性的異質(zhì)性有關(guān)。為了探討外翻的錨蛋白與整合素αvβ3的結(jié)合能否介導(dǎo)巨噬細(xì)胞與紅細(xì)胞的黏附,本文通過對巨噬細(xì)胞黏附紅細(xì)胞的檢測以及封閉整合素αvβ3(封閉膜上的結(jié)合位點)和錨蛋白(封閉巨噬細(xì)胞表面的結(jié)合位點)的結(jié)合位點分析。結(jié)果表明,錨蛋白的外翻能誘發(fā)巨噬細(xì)胞的噬紅細(xì)胞作用,結(jié)合位點的封閉能明顯降低巨噬細(xì)胞對紅細(xì)胞的黏附數(shù)量。紅細(xì)胞程序性死亡往往起始于細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。提高的胞內(nèi)鈣離子濃度能夠激活半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶以及鈣依賴的酶,從而降解細(xì)胞骨架及分解蛋白質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞囊泡化等,最終細(xì)胞調(diào)亡。PKC是一種鈣離子依賴的酶,激活的PKC能夠誘導(dǎo)細(xì)胞胞外鈣離子的快速流入,促使其胞內(nèi)鈣離子水平的升高。同時激活的PKC也能誘導(dǎo)紅細(xì)胞膜蛋白的磷酸化,從而導(dǎo)致紅細(xì)胞膜骨架結(jié)合親和力的減弱。因此,本文運(yùn)用PKC的抑制劑Calphostin C(封閉PKC的激活位點)和Chelerythrine chloride(競爭性抑制激活的PKC的磷酸化作用位點)來分析鈣離子以及錨蛋白的磷酸化與紅細(xì)胞錨蛋白外翻的關(guān)系。結(jié)果表明,激活的PKC誘導(dǎo)細(xì)胞胞外鈣離子的流入以及錨蛋白的磷酸化作用共同促使紅細(xì)胞錨蛋白的外翻。此外,研究也表明僅僅是胞內(nèi)鈣離子水平的增加或者僅僅錨蛋白的磷酸化作用均不足以誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白的外翻。為了進(jìn)一步探討激活的PKC與紅細(xì)胞錨蛋白外翻的關(guān)系。本文通過不連續(xù)密度梯度離心法分離出老紅的紅細(xì)胞層,檢測其錨蛋白外翻、胞內(nèi)鈣離子以及錨蛋白磷酸化水平的情況。也檢測了PMA誘導(dǎo)不同密度層紅細(xì)胞的上述指標(biāo)變化情況。結(jié)果表明,在老化層中有一定數(shù)目的紅細(xì)胞呈現(xiàn)其錨蛋白的外翻。同時PMA對不同密度層紅細(xì)胞的錨蛋白外翻以及胞內(nèi)鈣離子有不同的影響(對不同密度層紅細(xì)胞錨蛋白的磷酸化水平影響卻不大)。這意味著在老化的紅細(xì)胞中存在著紅細(xì)胞程序性死亡的信號分子—錨蛋白外翻,同時也進(jìn)一步確認(rèn)了誘發(fā)紅細(xì)胞錨蛋白外翻的兩個必不可必少的條件(胞內(nèi)鈣離子水平的增加以及紅細(xì)胞錨蛋白的磷酸化作用)。本論文還檢測了PKC誘導(dǎo)的錨蛋白外翻對紅細(xì)胞變形性能的影響,以及PKC誘導(dǎo)的膜蛋白磷酸化作用導(dǎo)致膜骨架結(jié)合親和力的改變與紅細(xì)胞形變能力的變化關(guān)系。結(jié)果顯示,錨蛋白的外翻能夠引起紅細(xì)胞變形性能的減弱,錨蛋白的磷酸化作用引起的紅細(xì)胞膜骨架結(jié)合親和力的改變與紅細(xì)胞變形指數(shù)的變化關(guān)系不大,而蛋白4.1的磷酸化作用誘導(dǎo)的紅細(xì)胞膜骨架結(jié)合親和力的改變在紅細(xì)胞形變能力的變化關(guān)系中有著重要的作用。因此,錨蛋白的外翻以及膜骨架結(jié)合親和力的減少誘導(dǎo)的紅細(xì)胞形變能力的減弱進(jìn)一步促進(jìn)了巨噬細(xì)胞對該紅細(xì)胞的黏附。根據(jù)現(xiàn)有的研究成果和已發(fā)表的文獻(xiàn),我們推斷出激活的PKC一方面誘導(dǎo)了細(xì)胞胞外鈣離子的流入,然后胞內(nèi)鈣離子水平的提高激活了鈣離子依賴的酶,促使了細(xì)胞的囊泡化和膜蛋白結(jié)合親和力的減少,另一方面激活的PKC誘導(dǎo)的紅細(xì)胞錨蛋白的磷酸化,進(jìn)一步減弱膜骨架蛋白的相互作用,經(jīng)過這兩方面的相互作用,誘導(dǎo)了紅細(xì)胞錨蛋白的外翻,最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的噬紅細(xì)胞作用。
【關(guān)鍵詞】：紅細(xì)胞 錨蛋白外翻 PKC 紅細(xì)胞變形性能
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R331.1
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 中英文縮略詞列表11-12
• 1 緒論12-24
• 1.1 研究背景12-19
• 1.1.1 紅細(xì)胞程序性死亡12-14
• 1.1.2 紅細(xì)胞力學(xué)性能與紅細(xì)胞程序性死亡14-16
• 1.1.3 PKC與紅細(xì)胞程序性死亡16-19
• 1.2 問題的提出和研究意義19-21
• 1.2.1 問題的提出19-20
• 1.2.2 研究意義20-21
• 1.3 研究內(nèi)容和目的21-22
• 1.4 本課題的創(chuàng)新點22-24
• 2 PKC對紅細(xì)胞錨蛋白外翻的影響24-38
• 2.1 引言24-27
• 2.2 材料和方法27-32
• 2.2.1 PMA誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻的檢測27-29
• 2.2.2 PKC抑制劑對PMA誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻的檢測29-31
• 2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析31-32
• 2.3 實驗結(jié)果32-35
• 2.3.1 PMA對紅細(xì)胞錨蛋白外翻的影響32-33
• 2.3.2 PKC抑制劑對PMA誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻的影響33-35
• 2.4 分析與討論35-36
• 2.5 本章小結(jié)36-38
• 3 PKC誘導(dǎo)細(xì)胞胞外的鈣離子流入對紅細(xì)胞錨蛋白外翻的影響38-50
• 3.1 引言38-39
• 3.2 材料與方法39-44
• 3.2.1 PKC抑制劑對PMA誘導(dǎo)紅細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子水平變化的檢測39-41
• 3.2.2 胞內(nèi)鈣離子與錨蛋白外翻紅細(xì)胞的熒光雙標(biāo)檢測41-43
• 3.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析43-44
• 3.3 實實驗結(jié)果44-47
• 3.3.1 PKC抑制劑對PMA誘導(dǎo)紅細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子含量的影響44-46
• 3.3.2 胞內(nèi)鈣離子對紅細(xì)胞錨蛋白外翻的影響46-47
• 3.4 分析與討論47-48
• 3.5 本章小結(jié)48-50
• 4 PKC誘導(dǎo)膜蛋白磷酸化對紅細(xì)胞錨蛋白外翻的影響50-66
• 4.1 引言50-51
• 4.2 材料與方法51-60
• 4.2.1 紅細(xì)胞膜蛋白和胞間蛋白的提取51-53
• 4.2.2 錨蛋白的分離與純化53-54
• 4.2.3 紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE（5%-15%梯度膠）54-57
• 4.2.4 紅細(xì)胞PKC、錨蛋白和磷酸絲氨酸的免疫印跡57-59
• 4.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析59-60
• 4.3 實驗結(jié)果60-63
• 4.3.1 紅細(xì)胞錨蛋白的分離、純化和錨蛋白的磷酸化檢測60-61
• 4.3.2 時間依賴的錨蛋白磷酸化檢測61-62
• 4.3.3 紅細(xì)胞胞內(nèi)PKCα 的激活檢測62-63
• 4.4 分析與討論63-64
• 4.5 本章小結(jié)64-66
• 5 錨蛋白外翻對紅細(xì)胞力學(xué)性能的影響以及巨噬細(xì)胞對錨蛋白外翻紅細(xì)胞的噬紅細(xì)胞作用66-78
• 5.1 引言66
• 5.2 材料與方法66-72
• 5.2.1 PMA誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻的力學(xué)性質(zhì)檢測66-69
• 5.2.2 PMA誘導(dǎo)THP-1 分化成巨噬細(xì)胞以及其對錨蛋白外翻紅細(xì)胞的識別69-71
• 5.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析71-72
• 5.3 實驗結(jié)果72-74
• 5.3.1 PMA誘導(dǎo)的錨蛋白外翻對紅細(xì)胞形變能力的影響72-73
• 5.3.2 巨噬細(xì)胞對PMA誘導(dǎo)的錨蛋白外翻紅細(xì)胞的黏附影響73-74
• 5.4 分析與討論74-75
• 5.5 本章小結(jié)75-78
• 6 不同天齡紅細(xì)胞錨蛋白外翻的檢測以及PKC對不同天齡紅細(xì)胞錨蛋白外翻的影響78-92
• 6.1 引言78-79
• 6.2 材材料和方法79-85
• 6.2.1 密度剃度離心法分離不同天齡的紅細(xì)胞79-80
• 6.2.2 不同天齡紅細(xì)胞錨蛋白外翻和胞內(nèi)鈣離子的測定以及PMA對不同天齡紅細(xì)胞錨蛋白外翻和胞內(nèi)鈣離子的影響80-83
• 6.2.3 不同天齡紅細(xì)胞錨蛋白磷酸化的測定以及PMA對不同天齡紅細(xì)胞錨蛋白磷酸化的影響83-84
• 6.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析84-85
• 6.3 實驗結(jié)果85-88
• 6.3.1 密度剃度離心分離不同天齡的紅細(xì)胞85-86
• 6.3.2 紅細(xì)胞錨蛋白外翻和胞內(nèi)鈣離子的測定86-88
• 6.3.3 紅細(xì)胞錨蛋白磷酸化的測定88
• 6.4 分析討論88-89
• 6.5 本章小結(jié)89-92
• 7 PKC誘導(dǎo)膜骨架結(jié)合親和力的變化對脊椎生物紅細(xì)胞力學(xué)性能的影響92-108
• 7.1 引言92-93
• 7.2 材料和方法93-100
• 7.2.1 血液的收集93-94
• 7.2.2 人、雞、蛙、魚紅細(xì)胞PKC的激活94-95
• 7.2.3 人、雞、蛙、魚紅細(xì)胞變形性檢測95-96
• 7.2.4 人、雞、蛙、魚紅細(xì)胞楊氏模量檢測96-99
• 7.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析99-100
• 7.3 實驗結(jié)果100-105
• 7.3.1 PMA對人、雞、蛙、魚紅細(xì)胞形變能力的影響100-101
• 7.3.2 PMA對人、雞、蛙、魚紅細(xì)胞楊氏模量的影響101-105
• 7.4 分析討論105-107
• 7.5 本章小結(jié)107-108
• 8 PKC誘導(dǎo)人、雞、蛙、魚紅細(xì)胞蛋白 4.1 磷酸化的檢測及脊椎生物紅細(xì)胞蛋白 4.1 的氨基酸序列分析108-128
• 8.1 引言108-110
• 8.2 材料和方法110-120
• 8.2.1 紅細(xì)胞膜骨架蛋白Spectrin以及磷酸絲氨酸蛋白的免疫印跡分析110-112
• 8.2.2 紅細(xì)胞膜蛋白的提取112-113
• 8.2.3 紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE（5%-15%梯度膠）113-117
• 8.2.4 紅細(xì)胞膜蛋白Western Blot117-119
• 8.2.5 脊椎生物紅細(xì)胞蛋白 4.1 氨基酸序列分析119
• 8.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析119-120
• 8.3 實實驗結(jié)果120-125
• 8.3.1 紅細(xì)胞磷酸絲氨酸蛋白以及血影蛋白的免疫熒光染色結(jié)果120-121
• 8.3.2 紅細(xì)胞膜蛋白電泳121-122
• 8.3.3 紅細(xì)胞膜蛋白 4.1 磷酸化檢測122-123
• 8.3.4 紅細(xì)胞膜蛋白 4.1 氨基酸序列分析123-125
• 8.4 分析與討論125-126
• 8.5 本章小結(jié)126-128
• 9 結(jié)論與展望128-130
• 9.1 結(jié)論128-129
• 9.2 不足之處與后續(xù)工作展望129-130
• 致謝130-132
• 參考文獻(xiàn)132-146
• 附錄146-147
• A. 作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄146
• B. 參加科研項目情況146-147

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張云;王端順;張鴻卿;王瑞虹;薛紹白;;v-src,Ca~(2+),PKC和cAMP對3T3-tsLA90細(xì)胞間隙連接通訊的調(diào)節(jié)[J];北京師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);1992年02期

2 崔玉東;牛多形核白細(xì)胞(PMN)中P38 MAPK,PKC和PI3-K介導(dǎo)的NADPH氧化酶激活和吞噬作用(英文)[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2000年S1期

3 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 張彤彤;王征;梁建偉;魯海珍;韓亞玲;王明榮;;蛋白激酶PKCι蛋白表達(dá)升高與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[A];中國的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動中國西部經(jīng)濟(jì)與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學(xué)會大會論文摘要匯編[C];2011年

2 Si-Qiang REN;Jing-Zhi YAN;Xiao-Yan ZHANG;Yun-Fei BU;Wei-Wei PAN;Wen YAO;Tian TIAN;Wei LU;;PKCλ is critical in AMPA receptor phosphorylation and synaptic incorporation during LTP[A];中國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會第十屆全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2013年

3 夏婷;吳緒峰;陳惠禎;;卵巢癌中PKC和P-gp的表達(dá)及其臨床意義[A];全國子宮頸癌暨湖北省婦科腫瘤專業(yè)委員會第五次婦科腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 王思思;孫巍;楊世杰;;生物學(xué)靶標(biāo)PKC在蒺藜皂苷抗心肌缺血中的作用[A];2008心血管藥理學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2008年

5 馬大為;;代謝型谷氨酸受體和PKC有亞基選擇性的調(diào)節(jié)劑研究[A];生命科學(xué)與生物技術(shù)：中國科協(xié)第三屆青年學(xué)術(shù)年會論文集[C];1998年

6 王博石;劉曙光;汪曉敏;史志周;張彤彤;劉一臻;商利;張鈺;王明榮;;PKCι在食管癌中相互作用蛋白的篩選與鑒定[A];全國腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

7 胡曉輝;鄭珍珍;盛麗琴;潘平雷;宋偉;周東;商慧芳;;佛波酯誘導(dǎo)的蛋白激酶C(PKC)活化不影響TorisnA亞細(xì)胞分布[A];中華醫(yī)學(xué)會第十三次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 唐福州;PKC誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻誘發(fā)的巨噬細(xì)胞噬紅細(xì)胞作用[D];重慶大學(xué);2015年

2 宋宗斌;PKCγ調(diào)控慢性嗎啡耐受的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];中南大學(xué);2012年

3 胡桂芹;甲基汞致腦發(fā)育損傷及PKC和CaN介導(dǎo)的細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控[D];吉林大學(xué);2010年

4 李力卓;蛋白激酶C-α（PKC-α）在腎癌中與多藥耐藥相關(guān)性研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

5 彭鏡;PKC-α/p115RhoGEF/RhoA信號通路調(diào)控TNF-α致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的機(jī)制[D];中南大學(xué);2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 朱鐘鳴;PKCδ抑制劑對脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2006年

2 胡玉海;不同經(jīng)穴針刺對腦卒中偏癱痙攣狀態(tài)大鼠PKC表達(dá)影響的研究[D];黑龍江省中醫(yī)研究院;2012年

3 尹航;不同經(jīng)穴針刺對腦卒中偏癱痙攣狀態(tài)大鼠PKC水平影響的研究[D];黑龍江省中醫(yī)研究院;2011年

4 衛(wèi)瑋;活性氧與PKC在亞硒酸鈉誘導(dǎo)人急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡中的作用研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

5 李軍;PKC-α及PKC-ε在腎癌及其周圍正常組織中表達(dá)的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2002年

6 李光艷;PI-3K、DGAT_2、PKC-ε在大鼠非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制的作用研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2010年

7 付正香;PKC在收縮調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位機(jī)制中的作用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：PKC誘導(dǎo)紅細(xì)胞錨蛋白外翻誘發(fā)的巨噬細(xì)胞噬紅細(xì)胞作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：318201