本文關鍵詞：TALEN介導的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生產，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是羊乳中引起嬰幼兒乳過敏癥的主要過敏原之一。目前多采用生物化學方法對β-乳球蛋白進行加工處理以降低其致敏性,但并不能從根本上解決其致敏問題。靶向基因編輯技術和轉基因動物技術的發(fā)展為從根本上徹底消除乳汁中的β-乳球蛋白提供了可能。研究表明,TALEN介導的基因打靶可以在生物基因組特定位點進行精確的基因插入或刪除。本研究通過構建以山羊BLG基因第一外顯子為靶位點的TALENs表達載體及基因打靶載體,在山羊胎兒成纖維細胞中利用TALEN介導的基因打靶技術對BLG基因進行敲除,利用體細胞克隆技術生產BLG基因單敲除奶山羊;并通過在山羊體細胞中進行連續(xù)的基因打靶獲得BLG基因雙敲除奶山羊。研究內容如下:1.靶向山羊BLG基因TALENs表達載體的構建使用“TAL Effector-Nucleotide Targeter”篩選TALENs靶位點,利用單元組裝法構建TALEN表達載體,構建雙熒光報告載體,將TALEN表達載體與報告載體共同轉染HEK293細胞驗證其生物活性。結果顯示:以山羊BLG基因第一外顯子序列為靶位點,利用單元組裝法構建TALEN表達載體p TSBE1-R和p TRBE1-L,構建雙熒光報告載體p RFP-BE1-GFP,雙熒光報告系統(tǒng)檢測結果表明單元組裝法構建的TALENs表達載體可特異性識別并切割其對應靶位點。2.山羊BLG基因打靶載體的構建以西農莎能奶山羊基因組DNA為模板分別克隆不同大小的同源臂序列,分別構建3個靶向BLG基因的置換型基因敲除載體p BLG-neo、p BLG-neo-M和p BLG-puro。結果顯示:以ploxpⅡ為骨架載體構建的p BLG-neo和p BLG-neo-M均含有新霉素抗性篩選標記,其中p BLG-neo的5’和3’同源臂大小分別為1.1 kb和5.3 kb;p BLG-neo-M的5’和3’同源臂大小分別為1.1 kb和1.3 kb。p BLG-puro含有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性基因作為雙陽性篩選標記,其5’和3’同源臂大小均為1.0 kb。3.山羊胎兒成纖維細胞中BLG基因打靶效率的檢測將TALEN表達載體的質粒DNA或以其為模板體外轉錄制備的m RNAs電穿孔法轉染山羊胎兒成纖維細胞(goat fetal fibroblasts,GFFs),使用有限稀釋法獲取單細胞克隆,經PCR、測序鑒定檢測TALENs介導的非同源末端連接修復引起的BLG基因修飾效率;將基因打靶載體p BLG-neo和p BLG-neo-M分別轉染GFFs,經藥物篩選后,使用PCR鑒定檢測自然發(fā)生的同源重組介導的基因打靶效率;將TALENs的DNA或m RNAs與p BLG-neo或p BLG-neo-M共轉GFFs,經藥物篩選后,使用PCR鑒定檢測TALEN介導的基因打靶效率。結果顯示:將TALENs電轉染GFFs,有限稀釋法獲得303個單細胞克隆,經PCR、測序鑒定,并未發(fā)現(xiàn)BLG基因修飾突變體。僅轉染基因打靶載體至GFFs,共獲得G418抗性克隆1005個,經過PCR鑒定未發(fā)現(xiàn)基因打靶細胞。將TALENs與不同的打靶載體共轉GFFs,經藥物篩選和PCR鑒定,均獲得了打靶載體中PGK-neo片段定點整合至山羊BLG基因座的細胞克隆;另外發(fā)現(xiàn),必須同時進行5’端和3’端的PCR鑒定才能保證基因打靶鑒定的準確性經過兩輪5’端和3’端的PCR鑒定,TALENs DNA與p BLG-neo-M共轉GFFs獲得的598個G418抗性克隆中,有94個發(fā)生了基因打靶,效率為13.6%;TALENs m RNA與p BLG-neo-M共轉GFFs獲得的459個G418抗性克隆,有49個發(fā)生了基因打靶,效率為10.7%。另外發(fā)現(xiàn),將TALENs質粒DNA轉染GFFs,會發(fā)生TALENs表達載體在山羊基因組中的隨機整合。4.體細胞核移植生產BLG基因單敲除山羊以TALEN m RNAs介導的基因打靶細胞為核供體細胞進行核移植和胚胎移植生產克隆羊,并對出生后代進行PCR、測序及Southern blot鑒定。結果顯示:以BLG基因單敲除細胞為核供體共構建克隆胚胎1128枚,出生并存活克隆羊7只,經PCR、Southern blot鑒定,其均為BLG基因單敲除山羊;經測序比對鑒定,BLG基因第一外顯子信號肽序列后的20 bp序列被刪除,置換為打靶載體p BLG-neo中1935 bp的外源基因。5.BLG基因雙敲除山羊的生產取BLG基因單敲除(BLG+/-)山羊耳組織分離得到BLG+/-成體成纖維細胞,以p BLG-puro為打靶載體,在BLG+/-細胞中進行TALEN介導的二次基因打靶,經過嘌呤霉素篩選與PCR鑒定,檢測對BLG的另一等位基因的敲除效率;以TALENs m RNA介導的BLG基因雙敲除(BLG-/-)細胞作為核供體進行核移植及胚胎移植生產克隆羊,并對出生后代進行PCR、測序及Southern blot鑒定。結果顯示:將TALENs質粒DNA與打靶載體p BLG-puro共轉BLG+/-細胞,共獲得嘌呤霉素抗性克隆667個,經5’端和3’端PCR鑒定后,打靶陽性克隆為39個(5.85%);將TALENs m RNA與打靶載體p BLG-puro共轉BLG+/-細胞,共獲得嘌呤霉素抗性克隆647個,經5’端和3’端PCR鑒定后,打靶陽性克隆為33個(5.10%);對PCR鑒定陽性的克隆進行Southern blot鑒定,所有克隆均顯示為BLG基因雙等位基因發(fā)生打靶。共構建克隆胚805個,獲得克隆山羊3只,經PCR、Southern blot鑒定,其均為BLG基因雙敲除山羊。綜上所述,本研究建立了利用TALEN介導的基因打靶在動物體細胞中進行基因敲除的技術體系,并通過體細胞克隆分別獲得BLG基因單敲除奶山羊7只,BLG基因雙敲除奶山羊3只,為β-乳球蛋白敲除奶山羊的新品種培育提供了材料,為研究β-乳球蛋白功能以及以BLG基因座作為靶位點研制乳腺生物反應器奠定基礎。
【關鍵詞】：TALEN β-乳球蛋白 奶山羊 基因打靶 同源重組
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S827
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-15
• 文獻綜述15-39
• 第一章 β-乳球蛋白研究進展15-20
• 1.1 β-乳球蛋白結構15-16
• 1.2 β-乳球蛋白的生物功能16-17
• 1.3 β-乳球蛋白致敏性研究及其解決方法17-20
• 1.3.1 β-乳球蛋白的致敏性17-18
• 1.3.2 β-乳球蛋白的致敏性的降低與消除18-20
• 第二章 人工核酸酶在家畜靶向基因組編輯研究中的應用20-39
• 2.1 DNA雙鏈斷裂修復機制20-25
• 2.1.1 非同源末端連接修復途徑20-21
• 2.1.2 同源重組修復途徑21-24
• 2.1.3 修復途徑的選擇調控24
• 2.1.4 雙鏈斷裂修復時NHEJ和HR的合作24-25
• 2.2 人工核酸內切酶25-33
• 2.2.1 鋅指核酸酶25-27
• 2.2.2 類轉錄激活因子效應物核酸酶27-31
• 2.2.3 CRISPR/Cas931-33
• 2.3 人工核酸酶介導的NHEJ修復在家畜靶向基因組編輯中的應用33-38
• 2.4 人工核酸酶介導的HR修復在家畜靶向基因組編輯中的應用38-39
• 試驗研究39-93
• 第三章 靶向山羊BLG基因的TALENs表達載體的構建39-50
• 3.1 試驗材料39-40
• 3.1.1 菌株、質粒和細胞株39
• 3.1.2 主要試劑39-40
• 3.1.3 測試化驗加工40
• 3.2 試驗方法40-42
• 3.2.1 單元組裝法構建TALENs表達載體40-41
• 3.2.2 TALENs的生物活性驗證41-42
• 3.3 結果42-48
• 3.3.1 以山羊BLG基因為靶位點的TALENs表達載體的構建42-46
• 3.3.2 雙熒光報告系統(tǒng)驗證TALENs的生物活性46-48
• 3.4 討論48-49
• 3.5 小結49-50
• 第四章 山羊BLG基因打靶載體的構建50-59
• 4.1 試驗材料50-51
• 4.1.1 血液樣本50
• 4.1.2 菌株和質粒50
• 4.1.3 主要試劑50-51
• 4.1.4 測試化驗加工51
• 4.2 試驗方法51-53
• 4.2.1 山羊BLG基因打靶載體pBLG-neo-M的構建51-52
• 4.2.2 山羊BLG基因打靶載體pBLG-neo的構建52-53
• 4.2.3 山羊BLG基因打靶載體pBLG-puro的構建53
• 4.3 結果53-57
• 4.3.1 基因打靶載體pBLG-neo和pBLG-neo-M的構建53-55
• 4.3.2 基因打靶載體pBLG-puro的構建55-57
• 4.4 討論57-58
• 4.5 小結58-59
• 第五章 山羊體細胞中TALEN介導的基因打靶效率檢測59-73
• 5.1 試驗材料59-60
• 5.1.1 動物組織59
• 5.1.2 主要試劑59-60
• 5.1.3 測試化驗加工60
• 5.2 試驗方法60-65
• 5.2.1 西農莎能奶山羊胎兒成纖維細胞的培養(yǎng)與性別鑒定60-61
• 5.2.2 山羊胎兒成纖維細胞中TALEN介導的NHEJ引起的BLG基因修飾61-62
• 5.2.3 山羊胎兒成纖維細胞中TALEN介導的山羊BLG基因打靶效率62-65
• 5.3 結果65-69
• 5.3.1 山羊胎兒成纖維細胞的培養(yǎng)與性別鑒定65
• 5.3.2 山羊胎兒成纖維細胞中山TALEN介導的NHEJ引起的BLG基因修飾檢測65-66
• 5.3.3 山羊胎兒成纖維細胞中TALENs介導的BLG基因打靶效率檢測66-69
• 5.4 討論69-71
• 5.5 小結71-73
• 第六章 體細胞核移植生產BLG基因單敲除奶山羊73-82
• 6.1 試驗材料73-74
• 6.1.1 實驗動物73
• 6.1.2 主要試劑73-74
• 6.1.3 測試化驗加工74
• 6.2 試驗方法74-76
• 6.2.1 體細胞核移植及胚胎移植74-75
• 6.2.2 轉基因山羊PCR和Southern鑒定75-76
• 6.3 結果76-79
• 6.3.1 基因打靶細胞的體細胞核移植及效率檢測76-78
• 6.3.2 轉基因山羊PCR和Southern鑒定78-79
• 6.4 討論79-81
• 6.5 小結81-82
• 第七章BLG基因雙敲除奶山羊的生產82-93
• 7.1 試驗材料82-83
• 7.1.1 實驗動物82
• 7.1.2 質粒和菌株82
• 7.1.3 主要試劑82-83
• 7.1.4 測試化驗加工83
• 7.2 試驗方法83-85
• 7.2.1 BLG基因單敲除成體成纖維細胞的培養(yǎng)83
• 7.2.2 二次基因打靶效率的檢測83-84
• 7.2.3 BLG基因雙敲除山羊的生產及鑒定84-85
• 7.3 結果85-90
• 7.3.1 BLG基因單敲除成體成纖維細胞的培養(yǎng)85
• 7.3.2 二次基因打靶效率的檢測85-88
• 7.3.3 BLG基因雙敲除山羊的生產88-90
• 7.4 討論90-92
• 7.5 小結92-93
• 結論93-94
• 創(chuàng)新之處與進一步研究的課題94-95
• 參考文獻95-112
• 附錄 主要儀器112-114
• 縮略詞114-115
• 致謝115-116
• 作者簡介116

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 BAO Lei;CHEN HaiDe;JONG UiMyong;RIM CholHo;LI WenLing;LIN XiJuan;ZHANG Dan;LUO Qiong;CUI Chun;HUANG HeFeng;ZHANG Yan;XIAO Lei;FU ZhiXin;;Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J];Science China(Life Sciences);2014年02期

2 曹隨忠;岳成鶴;李西睿;馮沖;龍川;潘登科;;鋅指核酸酶技術制備肌肉生長抑制素基因敲除的五指山小型豬成纖維細胞[J];遺傳;2013年06期

  本文關鍵詞：TALEN介導的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生產，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：317898