本文關(guān)鍵詞：迭代酮還原酶SiaM三維結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：聚酮類化合物是一類具有結(jié)構(gòu)及生物活性多樣性的重要天然產(chǎn)物。此類化合物擁有巨大的醫(yī)用價(jià)值,是一類抗細(xì)菌、抗真菌以及抗寄生蟲的高效抗生素,而且還是非常有潛力的抗癌藥物候選分子。聚酮化合物由巨大的、模塊化的聚酮合酶(PKSs)合成。PKSs中的每一個(gè)模塊負(fù)責(zé)鏈的延伸和鏈的修飾。加工好的聚酮化合物則被運(yùn)輸?shù)较乱粋�(gè)模塊進(jìn)行鏈的延伸。PKSs一般參與聚酮化合物的碳骨架的合成,一般具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：酮合成酶結(jié)構(gòu)域(KS),乙酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(AT)和乙酰轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域(ACP)。除此外,許多PKS模塊還具有參與p碳上酮基修飾的酶,即酮還原酶(KRs)。酮還原酶可以將p-酮基還原成p-羥基。在聚酮化合物的生物合成中,酮還原酶(KRs)催化的還原反應(yīng)決定了p碳的手性特征。目前,幾個(gè)代表性的聚酮還原酶結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析出來(lái)。其結(jié)構(gòu)中的Rossmann折疊負(fù)責(zé)結(jié)合NADPH輔因子,而催化三聯(lián)體色氨酸、絲氨酸和賴氨酸則位于NADPH結(jié)合位點(diǎn)附近。KRs底物位于煙堿環(huán)附近,這使得質(zhì)子可以進(jìn)攻β羰基。比對(duì)A類型和B類型的KR結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn),LDD殘基和保守的色氨酸位于活性位點(diǎn)不同的一側(cè)。前期研究顯示,LDD殘基可以引導(dǎo)底物進(jìn)入酶活位點(diǎn)。 大部分KRs催化固定長(zhǎng)度的底物。最新研究發(fā)現(xiàn),在對(duì)稱二聚聚酮化合物SIA7248的生物合成中,海洋鏈霉菌Streptomyces sp. A7248迭代酮還原酶SiaM能夠還原不同長(zhǎng)度的p酮酯酰底物。為了闡明SiaM的催化機(jī)理和底物結(jié)合方式,我們解析了其晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明,SiaM的結(jié)構(gòu)與已經(jīng)報(bào)道的其它類型KRs類似,但其保守序列LDD被IRD取代。PISA分析及小角散射實(shí)驗(yàn)顯示,SiaM在溶液中以四聚體形式存在,其四聚體界面上的芳香族氨基酸殘基可以與鄰近單體的芳香族殘基同時(shí)形成平行型和T型芳香堆積作用,這在聚酮合酶中是鮮有報(bào)道的。針對(duì)這些芳香族氨基酸的突變實(shí)驗(yàn)顯示,它們?cè)诰S持SiaM結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與催化功能中起著重要的作用。 將SiaM與NADPH以及與C4-SNAC底物分子進(jìn)行分子對(duì)接,并通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬表明SiaM_NADPH和SiaM_NADPH_C4-SNAC是穩(wěn)定的構(gòu)象。以SiaM_NADPH和SiaM_NADPH_C4-SNAC對(duì)接結(jié)構(gòu)模型為基礎(chǔ),針對(duì)SiaM與NADPH和C4-SNAC的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一系列突變體。突變體酶活和酶學(xué)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Y159、K163、D67和N94氨基酸殘基的側(cè)鏈與NADPH形成氫鍵作用,對(duì)SiaM酶功能起著重要作用。而S146在催化過(guò)程中起著電子傳遞的作用,對(duì)酶功能的維持起著關(guān)鍵性的作用。兩個(gè)疏水氨基酸殘基M196和198通過(guò)疏水作用與NADPH結(jié)合,對(duì)穩(wěn)定酶活性構(gòu)象起著重要作用。同時(shí),M196和198也通過(guò)疏水作用與SiaM底物C4-SNAC結(jié)合。并且,F151和M247也通過(guò)疏水作用對(duì)底物起著固定作用。因此,M196和198很有可能與其它疏水氨基酸殘基M247、V147、L191以及F151形成疏水口袋,通過(guò)疏水作用與底物結(jié)合。同時(shí),Q156、Q198和R206的側(cè)鏈與C4-SNAC形成氫鍵作用,對(duì)底物起著固定作用。 另外,SiaM_NADPH與不同長(zhǎng)度底物(C6-SNAC, C8-SNAC, C10-SNAC)的分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示,SiaM的loop區(qū)(191-200氨基酸基序)具有較大的擺動(dòng)性,因此,SiaM可以通過(guò)對(duì)M196、I98、V147、L191以及M247等形成的疏水口袋大小的調(diào)節(jié),以此結(jié)合和催化不同長(zhǎng)度的底物。 本研究初步闡明了SiaM與不同底物的結(jié)合方式,為SiaM的酶工程改造提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：聚酮化合物 酮還原酶 X射線晶體學(xué) 小角散射 分子對(duì)接 分子動(dòng)力學(xué)模擬 芳香堆積作用
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q55
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 緒論10-57
• 1.1 聚酮化合物的特征及功能10-11
• 1.2 聚酮化合物的生物合成11-15
• 1.3 聚酮合酶遺傳學(xué)研究進(jìn)展15-16
• 1.4 聚酮合酶以及ACP的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展16-20
• 1.5 酮還原酶研究進(jìn)展20-21
• 1.6 芳香堆積研究進(jìn)展21-28
• 1.7 圓二色譜研究進(jìn)展28-31
• 1.8 熒光光譜研究進(jìn)展31-32
• 1.9 小角散射研究進(jìn)展32-37
• 1.10 分子對(duì)接研究進(jìn)展37-43
• 1.11 分子動(dòng)力學(xué)模擬研究進(jìn)展43-45
• 1.12 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展45-53
• 1.13 研究背景及意義53-55
• 1.14 技術(shù)路線55-57
• 第二章 SiaM晶體結(jié)構(gòu)的研究57-84
• 2.1 SiaM的蛋白表達(dá)、純化及結(jié)晶57-71
• 2.2 SiaM晶體衍射數(shù)據(jù)的收集及結(jié)構(gòu)解析71-76
• 2.3 SiaM蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分析76-83
• 2.4 本章小結(jié)83-84
• 第三章 SiaM界面芳香堆積作用的研究84-96
• 3.1 小角散射對(duì)溶液中SiaM四聚體的研究84-86
• 3.2 SiaM及其突變體的酶活測(cè)定86-91
• 3.3 SiaM及其突變體的熒光光譜分析91-93
• 3.4 SiaM及其突變體的圓二色譜分析93-95
• 3.5 本章小結(jié)95-96
• 第四章 SiaM與不同長(zhǎng)度底物結(jié)合方式的研究96-153
• 4.1 SiaM底物β-keto-butanoyl-SNAC的合成與表征96-102
• 4.2 SiaM同源建模102-105
• 4.3 SiaM與配體分子對(duì)接105-119
• 4.4 SiaM和SiaM-配體復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬119-139
• 4.5 SiaM與不同長(zhǎng)度底物結(jié)合方式的研究139-152
• 4.6 本章小結(jié)152-153
• 第五章 總結(jié)與展望153-157
• 5.1 全文總結(jié)153-155
• 5.2 展望155-157
• 致謝157-159
• 參考文獻(xiàn)159-183
• 附錄1 博士研究生期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文183-184
• 附錄2 基因序列184-185
• 附錄3 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備185-186

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