本文關(guān)鍵詞：玉米逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PZmCKS2、PZmCBF3及轉(zhuǎn)錄因子ZmZBED的功能解析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：逆境脅迫是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中影響糧食產(chǎn)量最重要的因素和挑戰(zhàn)之一。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物抗逆性是有效應(yīng)對(duì)逆境挑戰(zhàn)的根本途徑，而克隆和組建逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是進(jìn)行多抗基因轉(zhuǎn)化從而實(shí)現(xiàn)分子育種目標(biāo)的重要保障。目前，從實(shí)踐上應(yīng)用的啟動(dòng)子來看，仍以CaMV35S、玉米Ubiquitin promoter等組成型表達(dá)啟動(dòng)子為主，無法實(shí)現(xiàn)高效、可控和特異（定點(diǎn)、定時(shí)、定量）的調(diào)控，，而且由35S啟動(dòng)的基因過表達(dá)會(huì)使轉(zhuǎn)基因植物生長發(fā)育產(chǎn)生一些負(fù)面效應(yīng)，如矮化等。而誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子能指導(dǎo)外源基因在植物發(fā)育過程中某一特定時(shí)間和空間里進(jìn)行表達(dá)，并使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定時(shí)間進(jìn)行積累，避免了植物營養(yǎng)的浪費(fèi)，也降低了對(duì)植物的不良影響。因此克隆并應(yīng)用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來啟動(dòng)抗逆基因的表達(dá)，在提高植物的抗性方面具有重要意義。 本課題組應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)玉米幼苗在低溫和干旱條件下的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，獲得了逆境脅迫誘導(dǎo)下基因的表達(dá)信息。以此為基礎(chǔ)，本研究篩選了玉米中受低溫、干旱誘導(dǎo)顯著表達(dá)的蛋白激酶基因（ZmCKS2）和轉(zhuǎn)錄因子（ZmCBF3）基因?yàn)檠芯繉?duì)象，與玉米B73全基因組序列比對(duì)、查詢了表達(dá)基因上游DNA序列。利用特異性引物對(duì)ZmCKS2和ZmCBF3啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆，構(gòu)建了5′-端缺失表達(dá)載體，并對(duì)其介導(dǎo)的GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)進(jìn)行了分析；同時(shí)利用酵母單雜交技術(shù)分離到一個(gè)可以和ZmCKS2啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其進(jìn)行了初步的功能分析，主要結(jié)果如下： 1.通過實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)ZmCKS2基因表達(dá)受低溫、干旱和ABA的誘導(dǎo)。為此，根據(jù)ZmCKS2基因編碼區(qū)的上游序列，設(shè)計(jì)特異性引物，從玉米基因組中克隆到長度為1853bp的ZmCKS2啟動(dòng)子。對(duì)啟動(dòng)子序列在線預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)該序列中含有多種順式作用元件，如MBS、CE3、TGA-element和ABRE等。 2.將ZmCKS2啟動(dòng)子定向替換植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301中35S啟動(dòng)子，將其與GUS報(bào)告基因融合，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZmCKS2啟動(dòng)子受非生物脅迫（干旱、低溫）和不同激素（ABA、 MeJA、SA）的多因素誘導(dǎo)。 3.構(gòu)建ZmCKS2啟動(dòng)子5′-端一系列缺失表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥。結(jié)果顯示，缺失啟動(dòng)子P1(999)具有最高的基本表達(dá)活性，缺失啟動(dòng)子P2(367)是受低溫、MeJA和SA誘導(dǎo)的最小的啟動(dòng)子片段。一些順式作用元件對(duì)ZmCKS2啟動(dòng)子受脅迫和激素的誘導(dǎo)起重要作用。通過ABREs功能分析發(fā)現(xiàn)，ABRE和CE3元件是ZmCKS2基因的正調(diào)控元件，二者需要同時(shí)存在才能響應(yīng)ABA信號(hào)并發(fā)揮作用；ABRE和CE3元件的作用效果與二者的數(shù)量不成正比例。 4.通過對(duì)ZmCBF3基因啟動(dòng)子5′-端一系列缺失表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥功能分析，結(jié)果表明ZmCBF3起始密碼子上游234bp的啟動(dòng)子序列在各缺失具啟動(dòng)子中活性最強(qiáng)。ZmCBF3啟動(dòng)子活性受低溫的誘導(dǎo)，MYCCONSENSUSAT elements(CANNTG)對(duì)此啟動(dòng)子在低溫下的表達(dá)起到正調(diào)控作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ZmCBF3啟動(dòng)子在根中具有較強(qiáng)的組織特異性表達(dá)活性，這與根特異性表達(dá)元件RAV1AAT和ROOTMOTIFPOX1有關(guān)。 5.利用酵母單雜交技術(shù)分離到一個(gè)可以和ZmCKS2啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，該基因編碼區(qū)編碼174個(gè)氨基酸，包含一個(gè)由65個(gè)氨基酸組成的BED鋅指結(jié)合域，起于第78個(gè)氨基酸終于第142個(gè)氨基酸。同源序列比較發(fā)現(xiàn)，該基因與其它生物物種的同源性比較低，與煙草、番茄和擬南芥的同源性分別為14.47%，8.48%和4.66%。該基因命名為ZmZBED。經(jīng)在線軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白沒有信號(hào)肽，定位于細(xì)胞核中。 6.通過煙草瞬時(shí)表達(dá)活性分析，研究了ZmZBED與ZmCKS2啟動(dòng)子的互作。結(jié)果表明，ZmZBED是ZmCKS2啟動(dòng)子的正調(diào)控因子，可以調(diào)控ZmCKS2基因的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：玉米 啟動(dòng)子 逆境誘導(dǎo) 酵母單雜交 轉(zhuǎn)錄因子 功能分析
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 英文縮寫詞表13-15
• 第1章 緒論15-35
• 1.1 植物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能研究15-27
• 1.1.1 真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)15-18
• 1.1.2 啟動(dòng)子類型18-24
• 1.1.2.1 組成型啟動(dòng)子20-21
• 1.1.2.2 組織特異性啟動(dòng)子21-23
• 1.1.2.3 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子23-24
• 1.1.3 啟動(dòng)子克隆方法24-25
• 1.1.4 啟動(dòng)子序列分析25-26
• 1.1.5 啟動(dòng)子活性測定的方法步驟26-27
• 1.1.5.1 組織化學(xué)染色法26-27
• 1.1.5.2 Southern 雜交、 Western 雜交、酶聯(lián)免疫法27
• 1.2 鋅指型轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆中的研究27-33
• 1.2.1 植物 C2H2型鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)分析28-31
• 1.2.1.1 DNA 結(jié)合域28-30
• 1.2.1.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域30-31
• 1.2.2 C2H2型鋅指蛋白參與生物和非生物逆境響應(yīng)31-32
• 1.2.3 轉(zhuǎn)基因植物過表達(dá) C2H2型轉(zhuǎn)錄因子后的抗逆性32-33
• 1.2.4 C2H2型轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中的作用33
• 1.3 本研究的目的意義33-35
• 第2章 ZmCKS2 啟動(dòng)子的克隆及功能分析35-77
• 2.1 材料35-41
• 2.1.1 植物材料、菌株及載體35-36
• 2.1.2 主要試劑36
• 2.1.3 主要設(shè)備36-37
• 2.1.4 試劑配制37-41
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法41-59
• 2.2.1 ZmCKS2 基因啟動(dòng)子（PZmCKS2）的克隆41-45
• 2.2.1.1 CTAB 法提取植物 DNA41
• 2.2.1.2 引物設(shè)計(jì)41-42
• 2.2.1.3 PCR 擴(kuò)增目的片段42
• 2.2.1.4 DNA 片段的純化與回收42
• 2.2.1.5 目的片段與 T 載體的連接42-43
• 2.2.1.6 熱擊感受態(tài) DH5α細(xì)胞的制備43-44
• 2.2.1.7 重組質(zhì)粒向大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化44
• 2.2.1.8 重組質(zhì)粒單菌落的快速鑒定44
• 2.2.1.9 重組質(zhì)粒的提取和酶切鑒定44-45
• 2.2.1.10 序列測定45
• 2.2.2 啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析45
• 2.2.3 植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建45-47
• 2.2.3.1 植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建方法45-46
• 2.2.3.2 重組質(zhì)粒 PZmCKS2:pMD18-T 和載體 pCAMBIA1301 酶切46
• 2.2.3.3 目的片段與表達(dá)載體的連接46
• 2.2.3.4 農(nóng)桿菌感受態(tài) EHA105 的制備和轉(zhuǎn)化46-47
• 2.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 GUS 基因在玉米種子中的瞬時(shí)表達(dá)47-48
• 2.2.4.1 玉米種子的提前處理47
• 2.2.4.2 農(nóng)桿菌侵染發(fā)芽的玉米種子47-48
• 2.2.4.3 GUS 組織的化學(xué)染色48
• 2.2.5 材料的逆境脅迫處理48
• 2.2.6 植物 RNA 的提取48-49
• 2.2.7 單鏈 cDNA 的合成49
• 2.2.8 實(shí)時(shí)定量（Real-time） PCR49-50
• 2.2.9 5′-端缺失啟動(dòng)子的構(gòu)建50
• 2.2.10 擬南芥侵染50-51
• 2.2.11 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選鑒定51
• 2.2.12 GUS 組織染色和定量分析51-52
• 2.2.12.1 GUS 組織染色的方法51
• 2.2.12.2 GUS 定量分析51-52
• 2.2.13 植物核蛋白的提取52-53
• 2.2.14 凝膠阻滯（EMSA）53-57
• 2.2.15 ABA 應(yīng)答作用元件表達(dá)載體的構(gòu)建57-58
• 2.2.16 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片轉(zhuǎn)化及逆境處理58-59
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析59-73
• 2.3.1 ZmCKS2 啟動(dòng)子（PZmCKS2）的克隆和序列分析59-62
• 2.3.2 ZmCKS2 在非生物脅迫下的表達(dá)62-63
• 2.3.3 ZmCKS2 啟動(dòng)子植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建63
• 2.3.4 ZmCKS2 啟動(dòng)子活性的初步鑒定63-64
• 2.3.5 5′-端缺失啟動(dòng)子的構(gòu)建64-65
• 2.3.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選與 PCR 鑒定65-66
• 2.3.7 不同啟動(dòng)子片段在擬南芥中的基本表達(dá)活性分析66-67
• 2.3.8 不同啟動(dòng)子片段在逆境條件下的表達(dá)活性分析67-69
• 2.3.9 不同啟動(dòng)子片段在激素誘導(dǎo)下的表達(dá)活性分析69
• 2.3.10 ABA 應(yīng)答元件（ABREs）的功能分析69-73
• 2.3.10.1 ABA 應(yīng)答元件與玉米核蛋白的結(jié)合69-71
• 2.3.10.2 ABA 應(yīng)答元件植物表達(dá)載體的構(gòu)建71-72
• 2.3.10.3 ABA 應(yīng)答元件的功能分析72-73
• 2.4 討論73-77
• 第3章 ZmCBF3 基因啟動(dòng)子的克隆和功能分析77-95
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑77-80
• 3.1.1 植物材料、菌株及載體77-78
• 3.1.2 主要試劑78
• 3.1.3 主要設(shè)備78
• 3.1.4 試劑配制78-80
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法80-83
• 3.2.1 ZmCBF3 基因啟動(dòng)子（PZmCBF3）的克隆80-83
• 3.2.1.1 CTAB 法提取植物 DNA80
• 3.2.1.2 引物設(shè)計(jì)80-81
• 3.2.1.3 PCR 擴(kuò)增目的片段81
• 3.2.1.4 重組質(zhì)粒 PZmCBF3:pMD18-T 和載體 pCAMBIA1301 酶切81-82
• 3.2.1.5 目的片段與表達(dá)載體的連接82
• 3.2.1.6 5′-端缺失啟動(dòng)子的構(gòu)建82-83
• 3.3 結(jié)果與分析83-92
• 3.3.1 ZmCBF3 啟動(dòng)子（PZmCBF3）的克隆和序列分析83-86
• 3.3.2 ZmCBF3 啟動(dòng)子植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建86-87
• 3.3.3 5′-端缺失啟動(dòng)子的構(gòu)建87-88
• 3.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選與 PCR 鑒定88-89
• 3.3.5 不同啟動(dòng)子片段在擬南芥中的基本表達(dá)活性分析89
• 3.3.6 不同啟動(dòng)子片段在逆境條件下的表達(dá)活性分析89-92
• 3.3.7 組織特異性表達(dá)分析92
• 3.4 討論92-95
• 第4章 轉(zhuǎn)錄因子 ZmZBED 基因的克隆與功能分析95-113
• 4.1 材料95-96
• 4.1.1 植物材料、菌株及載體95
• 4.1.2 主要試劑95-96
• 4.1.3 主要設(shè)備96
• 4.1.4 主要試劑的配制96
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法96-101
• 4.2.1 酵母感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化96-97
• 4.2.2 PCR 鑒定酵母轉(zhuǎn)化子克隆97
• 4.2.3 酵母質(zhì)粒的提取97-98
• 4.2.4 酵母單雜交 cDNA 文庫的構(gòu)建和質(zhì)量檢測98-99
• 4.2.4.1 庫容量的鑒定98
• 4.2.4.2 重組率和插入片段長度鑒定98-99
• 4.2.5 誘餌質(zhì)粒和文庫質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化99-100
• 4.2.6 陽性酵母克隆的篩選100
• 4.2.7 ZmZBED 基因特性在線分析100
• 4.2.8 ZmZBED 植物表達(dá)載體的構(gòu)建100-101
• 4.2.9 ZmZBED 對(duì) PZmCKS2 啟動(dòng)子在煙草中瞬時(shí)表達(dá)活性的影響分析101
• 4.3 結(jié)果與分析101-111
• 4.3.1 酵母單雜誘餌載體的構(gòu)建101-102
• 4.3.2 酵母單雜 cDNA 文庫的質(zhì)量鑒定102
• 4.3.2.1 酵母 cDNA 文庫總克隆數(shù) CFU 的鑒定102
• 4.3.2.2 文庫插入片段長度鑒定102
• 4.3.3 誘餌載體和 cDNA 文庫質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化與篩選102-104
• 4.3.4 陽性克隆的復(fù)篩104
• 4.3.5 陽性克隆的序列分析104-106
• 4.3.6 ZmZBED 基因的生物信息學(xué)分析106-108
• 4.3.6.1 ZmZBED 氨基酸序列特征分析106-107
• 4.3.6.2 ZmZBED 亞細(xì)胞定位預(yù)測107-108
• 4.3.6.3 ZmZBED 的信號(hào)肽分析108
• 4.3.7 ZmZBED 同源性比對(duì)與進(jìn)化樹分析108-110
• 4.3.8 ZmZBED 對(duì) PZmCKS2 啟動(dòng)子在煙草中瞬時(shí)表達(dá)活性的影響分析110-111
• 4.4 討論111-113
• 結(jié)論113-115
• 論文的創(chuàng)新、問題與展望115-117
• 參考文獻(xiàn)117-129
• 附表：本實(shí)驗(yàn)所用引物匯總129-131
• 作者簡介及科研成果131-133
• 致謝133

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 楊梅;熊立仲;;水稻干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Oshox24P的分離與鑒定[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年05期

2 張中保;盧敏;李會(huì)勇;張登峰;劉穎慧;石云素;宋燕春;王天宇;黎裕;;玉米干旱誘導(dǎo)表達(dá)基因ZmCKS2的克隆與表達(dá)分析[J];作物學(xué)報(bào);2010年06期

3 吳純清;張興國;梁國魯;蘇承剛;;擬南芥AtRD29a啟動(dòng)子在煙草中的表達(dá)特性[J];西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2008年04期

4 吳田;謝從華;;馬鈴薯蛋白激酶基因StPK1啟動(dòng)子的克隆及活性分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年05期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫清華;鹽芥TsVP啟動(dòng)子核心區(qū)域的鑒定及其上游調(diào)控蛋白的功能分析[D];山東大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：玉米逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PZmCKS2、PZmCBF3及轉(zhuǎn)錄因子ZmZBED的功能解析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：298491