本課題主要進(jìn)行了兩部分內(nèi)容的研究。 1.馬克思克魯維酵母木糖代謝工程改造研究 利用微生物轉(zhuǎn)化半纖維素生產(chǎn)清潔可再生能源乙醇一直是生物能源研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一,但是自然界中并沒(méi)有可以直接高效轉(zhuǎn)化半纖維素的微生物菌株。近年來(lái)諸多研究利用遺傳工程對(duì)釀酒酵母和其他酵母菌株進(jìn)行遺傳改造以期得到高效發(fā)酵木糖的菌株,其難點(diǎn)在于酵母對(duì)五碳糖,尤其木糖的發(fā)酵能力不強(qiáng)。在酵母的木糖代謝路徑中,木糖經(jīng)木糖還原酶形成木糖醇,隨后經(jīng)木糖醇脫氫酶將木糖醇轉(zhuǎn)換為木酮糖,進(jìn)一步代謝,最終得到乙醇。研究不同菌株木糖代謝路徑中的相關(guān)酶,是進(jìn)一步研究生物轉(zhuǎn)化可再生能源等相關(guān)問(wèn)題的基礎(chǔ)。 馬克斯克克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)具有可以和釀酒酵母相媲美的利用葡萄糖發(fā)酵的能力,又有釀酒酵母所不具備的木糖利用及發(fā)酵的能力,因此,在發(fā)酵木糖工程菌的改造方面具有較大潛力,但是其發(fā)酵木糖能力較低。探索馬克思克魯維酵母發(fā)酵木糖的限制性因素是對(duì)其改造利用的重要環(huán)節(jié)。本研究主要通過(guò)克隆馬克思克魯維酵母木糖還原酶基因Kmxyll,初步研究木糖還原酶的基本性質(zhì),并分析其發(fā)酵木糖能力低的可能原因。根據(jù)木糖還原酶氨基酸序列中的保守部分結(jié)合TAIL-PCR方法,首次克隆得到馬克思克魯維酵母木糖還原酶基因Xyl1,并測(cè)序驗(yàn)證。在大腸桿菌中重組表達(dá)木糖還原酶蛋白并且對(duì)其進(jìn)行一系列的性質(zhì)測(cè)定,闡明馬克思克魯維酵母來(lái)源的木糖還原酶的基本性質(zhì)。馬克思克魯維酵母來(lái)源的木糖還原酶的最適輔酶是NADPH,對(duì)NADH則沒(méi)有活力。因此,木糖還原酶對(duì)NADPH的偏好性可能造成馬克思克魯維酵母在利用木糖的代謝途徑中還原力不平衡,從而導(dǎo)致其對(duì)木糖的發(fā)酵能力低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證克隆的木糖還原酶的正確性,我們構(gòu)建了木糖還原酶基因的敲除菌株YZB001,證明了木糖還原酶基因缺失的馬克思克魯維酵母不能利用木糖生長(zhǎng)。為了改善馬克思克魯維酵母在高溫下發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的能力,將畢赤酵母(Scheffersomyces stipitis NBRC10063)來(lái)源的木糖還原酶(PsXR)及其突變體PsXRN272D和PsXRK21A/N272D轉(zhuǎn)化進(jìn)YZB001菌株中。改造后的菌株能大幅提高馬克思克魯維酵母在高溫下利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的能力,其中PsXRN272D突變體效果最好。同野生型的馬克思克魯維酵母相比,重組馬克思克魯維酵母菌株YZB013(PsXR)和YZB014(PsXRN272D)同對(duì)照菌株YHJ010相比,在42℃時(shí)用20g/L木糖發(fā)酵分別提高了3.63倍和11.83倍的乙醇產(chǎn)量達(dá)到1.10g/L和3.55g/L乙醇。當(dāng)溫度上升到45℃時(shí),YZB014菌株能發(fā)酵20g/L的木糖產(chǎn)生2.27g/L的乙醇。在以玉米芯酸水解液為發(fā)酵原料在42℃發(fā)酵時(shí),YZB014菌株可以產(chǎn)生4.09g/L乙醇。重組馬克思克魯維菌株展現(xiàn)了其在利用生物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的潛力。 2.綠膿桿菌群體響應(yīng)系統(tǒng)Rhll蛋白的定向進(jìn)化 隨著具有抗藥性的細(xì)菌的出現(xiàn),開(kāi)發(fā)新型抗菌藥成為一個(gè)迫切的任務(wù)。抑制群體響應(yīng)是控制細(xì)菌感染的一個(gè)有效的途徑,同時(shí),群體響應(yīng)抑制藥物具有不易引起細(xì)菌抗藥性的優(yōu)點(diǎn)。開(kāi)發(fā)這類(lèi)高效藥物需要對(duì)群體響應(yīng)的LuxI同源蛋白及其與底物的相互作用的分子機(jī)制有清晰的理解。本研究的目標(biāo)是通過(guò)改造LuxI同源酶RhlI的底物特異性來(lái)取得LuxI同源酶與底物相互作用分子機(jī)制的詳細(xì)信息,從而為設(shè)計(jì)高效抑制綠膿桿菌群體響應(yīng)系統(tǒng)中RhlI酶的新型抗生素藥物,提供充分而必要的信息。為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo),本研究改造RhlI酶的底物特異性。設(shè)計(jì)了各種強(qiáng)度的篩選系統(tǒng),利用定向演化,通過(guò)改造RhlI使其能夠合成OHHL。通過(guò)設(shè)計(jì)一個(gè)綠色熒光蛋白作為信號(hào)輸出的篩選和半定量系統(tǒng),在第一輪的篩選過(guò)程中,通過(guò)三次篩選,篩選到了熒光值比出發(fā)蛋白分別提高了80.02%,167.45%和170.59%的突變體M8,S7和2M26。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了第二輪的篩選系統(tǒng),篩選到了突變體4M1產(chǎn)生信號(hào)分子激活熒光蛋白的能力比2M26提高了20.27%。這樣通過(guò)改變RhlI的底物特異性,我們對(duì)于RhlI催化的分子機(jī)理就會(huì)有一個(gè)清晰的理解,為開(kāi)發(fā)抑制群體響應(yīng)藥物提供有用而必要的信息。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：Q93
【部分圖文】：

XR-RS1、XR-RS2、XR-RS3。克隆出的序列經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)�？寺〕龅腒mxyU基因的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1.2，克隆出的基因序列及分析見(jiàn)圖1.4。CS7 0 CO=iill 11^ ilil^JinliKm-xR n | _ M I 【■作■？5-XR 67 P I |y<GD?J~Te-XR 69 - ] r、] [: [ 1 ICt-XR 7.1 M 1 ftS'- ^ m 1 1 ,,ONN—Kl-XR 71 譽(yù)-I B _、SB W I IKEDEAKt-xR '11 '、屋‘‘BwB TpjPP"'-?I^K'S S 1 ■^^AEDEKKm-XP 141 KE1 ISEli:l|l#H^8HdBi:i::|l.Ei0^^4^KS^?-E3' Z! inVlfiL 2 1Ps->;R 136 …邏K暴孺^ 工、I ‘T?~XR 137 |. iCt-XR 140 ---FVyIiJ P f 2■宏參醫(yī)‘ §、Ki-xR i4i kghieJcJ Sj S llgTOii-1… V gj^7Km—XR 211 AOK'v^fc vMfflHl|HfcNEK L暴.:參 i:醒丨 S M ■ ^K-Ps-XR 203 AQSRfc lMSG|A、TS-XR 204 VQKsjfc KDBFI^pH^Hsfcp | ^ SCt-XR 207 AQK^Ht r^^^K^^BNOGR LHlpT^E^lMWgMJ | m ■K:I -XR 211 vKNftft W ^ |^B'Kt-XB 21) cKocjP^v■琴Pj^^PD.3。rJjks{ki:^^!ii^(K:J — ^ ^oKm-XR 231 KKESBE :...AETFT SDE IKF： NO DQG| 耶r|7_TFs-XR 273 TVfH' ^ tJn-SFD DEQ FAD a ".1 I |"K—t|t,|VTe-XR 2'M NPllvj :暴-秘1) TE.^ S? NKuf ^^?'S|GI.:Y-I|I|ACt-XH 27 7 LPH^hc RSFK-TFLj IKE FEE AK DT'J LjoM - - l|l|vKI-XR 231 KKK^pr： '.KfeDALT XDH LKQ SG MOMI ||ByL"ll.,DNE FITIJKt-KS 2B1 :.Q^EKI.T『‘：~ IBB ：.規(guī)圖1.2不同酵母來(lái)源木糖還原酶的序列比對(duì)注：下劃線表示兼并引物設(shè)計(jì)的區(qū)域，活性位點(diǎn)(0),底物結(jié)合基團(tuán)（?)，輔酶結(jié)合區(qū)域(▽)分別標(biāo)識(shí)出來(lái)，方框顯示的是 ne-Pro-Lys-Ser 模體。A^wXR

Kmxyll同源區(qū)域內(nèi)的擴(kuò)增條帶

第1章馬克思克魯維酵母的木糖代謝及其工程改造的研究激轉(zhuǎn)化的方法將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸打菌中，然后誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。如圖1.5所示，用已經(jīng)成功克隆的Kmxyll基因，設(shè)計(jì)引物XR-NDE和XR-HIND并馬克思克魯維酵母的基因組DNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增出目的條帶，同質(zhì)粒一起酶切并檢測(cè)。5 kb3 kb 命2kb : “ "'Vtf*-, ?5* ? ** ??" *i kb . I ?750 bp500隱M 1 2圖1. 5質(zhì)粒pET21和Kmxyll基因的擴(kuò)增條帶酶切結(jié)果注：M: DL2000 plus II DNA marker： 1： pET21 條帶；2: Kmxyll 基因條帶載體和插入片段回收后連接并熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌。長(zhǎng)出的克隆用菌落PCR檢測(cè)以初步判斷連接成功與否。5 kb|P* ^ISSB 3 kbp 2 kbflHBBRHH. WfeUi.lit'wuKi''-- 〔-MHSSSaBKmiMMBM '-<1 2 3 4 5 6 7 8 M圖1. 6菌落PCR檢測(cè)質(zhì)粒pET21和KmxyU的連接情況注：M: DL2000 plus II DNA marker： 1-8：陽(yáng)性克隆構(gòu)建好表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)入到表達(dá)菌株E C0//BL21 (DE3)中，進(jìn)行最優(yōu)表達(dá)條件的摸索。接種表達(dá)菌株于5 mLLB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，第二天接種1%體積的菌種至7管新的LB中
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2862969